Apelin-13对5-Aza诱导脐带间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

徐小红，王力，张宁坤，郑楠，高连如，朱智明

Apelin-13对5-Aza诱导脐带间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

徐小红，王力，张宁坤，郑楠，高连如，朱智明

目的探讨apelin-13蛋白在体外对5-氮胞苷(5-Aza)诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向心肌细胞分化的影响。方法采用组织块贴壁法培养hUC-MSCs，胰酶消化传代；取P2代细胞置于不同分化条件的培养液中分化培养14d，实验分为A、B、C、D组(apelin-13浓度分别为0、1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L)，各组培养基中5-Aza浓度均为10×10－6mol/L。采用流式细胞仪检测hUC-MSCs表面免疫标记，MTT法检测细胞在570nm处的吸光度(A)值，RTPCR检测肌钙蛋白T(cTnT)、GATA-4 mRNA表达水平，免疫组织化学染色法检测心肌细胞表面标志物cTnT的表达。结果流式细胞仪鉴定结果表明，hUC-MSCs表达CD44、CD90、CD105、CD73、经典人类白细胞抗原Ⅰ类抗原(HLAABC)，不表达CD34、CD45、经典人类白细胞抗原Ⅱ类抗原(HLA-DR)。MTT检测显示，0、10×10－6mol/L apelin-13处理的hUC-MSCs在570nm处的A值分别为0.841±0.290、0.875±0.325，差异无统计学意义(P＞0.05)。B、C、D组cTnT mRNA表达水平分别是A组的2.09±1.35、5.24±1.30、1.17±0.63倍，B、C、D组GATA-4 mRNA表达水平分别是A组的2.68±1.18、4.82±0.14、2.14±0.27倍；C组与B、D组比较，cTnT、GATA-4 mRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化染色显示，诱导14d后C组细胞cTnT蛋白表达呈阳性。结论10×10－6mol/L apelin-13对hUC-MSCs无毒性作用，一定浓度的apelin-13蛋白可增强5-Aza诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化的效率，浓度为2×10－6mol/L时增强作用最明显。

脐带；间质干细胞；心肌；细胞分化；apelin-13；5-氮胞苷

目前，药物、介入、外科搭桥手术均无法补充因心肌坏死丢失的心肌细胞，心肌梗死后缺血性心力衰竭的发病率正日益升高[1]。Wang等[2]采用apelin加含有bFGF、activin-A、BMP4的培养基诱导鼠和人胚胎干细胞向心肌细胞分化，证实apelin可以增强含bFGF、activin-A、BMP4的培养基诱导鼠和人胚胎干细胞向心肌细胞分化的能力。目前尚未见有关apelin蛋白在体外对5-氮胞苷(5-Aza)诱导hUCMSCs向心肌细胞分化影响的报道，本实验通过观察5-Aza联合apelin-13诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化的效率，探讨apelin蛋白在hUC-MSCs向心肌细胞分化中的作用，以期建立更优的诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化的方案。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 所有标本均取自海军总医院产科当日剖宫产健康婴儿的新鲜脐带，长度约8cm。胎龄37～40周，均无先天性疾病；产妇体健，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于实验研究均知情同意。Trizol(Gibco公司)；5-Aza、MTT(Sigma公司)；apelin-13(Santa Cruz公司)；兔抗人肌钙蛋白T(cTnT)抗体(工作浓度1:100，北京博奥森生物技术公司)；二抗为聚合HRP标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物公司)；DAB试剂盒、即用型兔IgG两步法免疫组化试剂盒(SV0002，武汉博士德生物公司)；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus，大连宝生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的分离、培养 无菌取剖宫产婴儿的新鲜脐带，以平衡盐溶液洗去脐带残留血液，剪成3～4cm的小段，每段均沿静脉腔剪开，平铺后剔除静脉，再深入剪开华通胶(血管之间、血管与外膜之间的胶状物)，剔除2根动脉，取华通胶并剪切成1mm3及以下小块，接种于T75培养瓶内，细胞贴壁约90%融合后传代培养。

1.2.2 hUC-MSCs的鉴定 流式细胞仪检测细胞表面标志物：取扩增传代2代的脐带华通胶间充质干细胞，弃培养基，PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化，血清终止消化，用PBS洗涤、重悬，调整细胞密度为1×106/ml，取1ml/管，共8管，分别加入鼠抗人单克隆抗体PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD73、PE-HLA-ABC、FITC-CD45、FITCCD34、FITC-HLA-DR各20μl，充分混匀，避光室温孵育30min，PBS洗2遍，250×g离心10min，重新制成细胞悬液0.5ml，流式细胞仪检测。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖情况 常规胰酶消化P2代细胞，得到细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，加新鲜培养基制成悬液，计数，调整细胞密度为1×105/ml，按2×104/孔接种于96孔板，加新鲜培养基培养24h。24h后弃旧培养基，实验分为对照组(单纯基础培养基)和实验组(含有10×10－6mol/L apelin-13的培养基处理细胞24h)，每组设5个复孔。继续置于37℃、5%CO2培养箱培养24h。24h后弃培养基，换新鲜培养基，各孔加10μl MTT(5mg/L)，4h后吸弃，加二甲基亚砜，在摇床上低速摇10min，用酶标仪检测两组细胞在570nm处的吸光度(A)值。

1.2.4 hUC-MSCs向心肌细胞的诱导分化 常规0.25%胰酶消化P2代细胞，血清终止消化，PBS洗涤、重悬，调整细胞密度为5×106/ml，接种于T25瓶，实验分为A、B、C、D 4组(apelin-13浓度分别为0、1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞约80%融合后向各组培养基中加入终浓度为10×10－6mol/L的5-Aza。继续置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。24h后弃培养基，继续换用新鲜培养基培养，以后每隔2～3d换液1次，B、C、D组每天分别加入1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L apelin-13。分别于诱导后1、7、10、14d在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

1.2.5 RT-PCR检测心肌细胞表面标志物mRNA表达 收集上述各组诱导14d后的细胞，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。取适量RNA进行反转录反应，以cDNA为模板，引物序列如下：cTnT，正义5'-ACAGAGCGGAAAAGTGGGAAG-3'，反义5'-TCGTTGATCCTGTTTCGGAGA-3'，产物大小230bp；GATA-4，正义5'- CGACACCCCAATCTCGA TATG-3'，反义5'-GTTGCACAGATAGTGACCCGT-3'，产物大小117bp；内参照GAPDH，正义5'-GACATG CCGCCTGGAGAAAC-3'，反义5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'，产物大小1166bp。使用Bio-Rad RCR仪进行扩增反应，总反应体系25μl。扩增条件：95℃ 30s；95℃ 5s、60℃ 60s，共40个循环。目的基因与内参照基因同时检测，每个样本设置3个复孔，比较各组间的差异，实验重复3次。

1.2.6 免疫组织化学染色检测心肌细胞表面标志物CTnT的表达 实验组(2×10－6mol/L apelin-13+10×10－6mol/L 5-Aza)细胞在T25瓶分化培养至11d时，以0.25%胰酶消化细胞，离心弃上清；加新鲜培养基制成悬液，调整细胞密度为5×104/ ml，接种于预置盖玻片的24孔板内。待细胞在盖玻片贴壁生长，融合达80%时，吸弃培养液。采用SP法行免疫组化检测cTnT的表达，按说明书操作，用PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，高倍镜观察结果。对照组不加apelin-13和5-Aza，其余处理同实验组。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；实验组与空白对照组的比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hUC-MSCs分离、传代培养结果 脐带华通胶组织块接种于完全培养基培养10d后，显微镜下可见在组织块周围有黏附培养瓶壁生长、成纤维细胞样、有伪足伸出、有折光性的细胞，15、16d后细胞融合(图1A)；按1×106个/75cm2培养瓶传代培养，3～5d后细胞即融合(图1B)。

图1 倒置显微镜下的hUC-MSCs形态(×40)Fig.1 Morphology of hUC-MSCs under inverted microscope (×40)

2.2 脐带间充质干细胞表面抗原分子表达 流式细胞仪检测显示，P2代hUC-MSCs高表达间充质干细胞抗原CD44、CD90、CD105、CD73，HLAABC，而不表达造血干细胞抗原CD45、CD34和白细胞相关抗原HLA-DR(图2)。

图2 hUC-MSCs表面标记物的流式细胞仪检测结果Fig.2 hUC-MSCs surface markers detected by flow cytometry

2.3 细胞增殖能力 MTT法检测显示：10×10－6mol/L的apelin-13可促进hUC-MSCs增殖，但与对照组相比差异无统计学意义(0.875±0.325vs0.841±0.290，P＞0.05)。

2.4 心肌细胞表面标志物cTnT、GATA-4 mRNA的表达 B、C、D组cTnT mRNA的表达水平分别是A组的2.09±1.35、5.24±1.30、1.17±0.63倍，C组与B、D组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而B组与D组间差异无统计学意义(P＞0.05)。B、C、D组GATA-4 mRNA的表达水平分别是A组的2.68±1.18、4.82±0.14、2.14±0.27倍，C组与B、D组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而B组与D组的表达差异无统计学意义(P＞0.05，图3)。

图3 心肌细胞表面标志物cTnT、GATA-4的mRNA表达Fig.3 mRNA expression of myocardial cell surface markers, cTnT and GATA-4

2.5 cTnT蛋白免疫组化检测结果 cTnT蛋白在实验组细胞有着色，着色位于细胞质，而对照组细胞未着色(图4)。

图4 cTnT蛋白表达的免疫组化检测结果(×200)Fig.4 Expression of cTnT protein detected by immunohistochemisty (×200)

3 讨 论

Apelin是孤儿G蛋白耦联受体血管紧张素受体1(AT1)相关受体的内源性配体，由Tatemoto等[3]于1998年从牛胃组织提取物中提取并纯化，近年研究发现apelin/APJ信号通路在心血管定向分化中具有极其重要的地位。Gao等[4]研究发现，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem，BMSCs)向心肌细胞分化中有APJ受体及其配体apelin表达，且随着BMSCs向心肌细胞的分化，APJ和apelin mRNA呈现出动态高表达。Gao等[5]进一步研究发现hUC-MSCs与胚胎干细胞表达类似水平的APJ及apelin mRNA。Apelin前体肽(preproApelin)含有77个氨基酸，其C末端为特异结合APJ受体的部位，富含碱性氨基酸残基，也是翻译后加工酶修饰剪切的部位，可被肽酶分解成多种相对分子量不同的成熟apelin活性肽，如apelin-36、apelin-17、apelin-13、apelin-12等[6]。近年来研究发现，apelin/APJ与胚胎心肌分化有关，外源性给予apelin mRNA可严重影响斑马鱼心肌的分化，表现为CMLC2、Nkx2.5表达下降[7]。Zeng等[8]研究也发现，apelin过表达会造成原肠胚受损，心肌细胞特异分化破坏，如局部apelin缺乏，则心脏前体细胞不能到达特定的生心区，即胚胎前侧中胚叶区域，进而影响心脏发育。Wang等[2]在蛋白水平证实了0.5mmol/L apelin-13可以增强bFGF、activin-A、BMP4诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化的能力。

cTnT是心肌细胞特异性的表面标志物，GATA-4是心脏形成过程中必需的剂量依赖性转录因子，参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达，还可与多种心肌基因调控区域结合，参与心肌细胞的分化过程。在心脏发育早期抑制GATA-4的表达将抑制前心肌细胞及分化终末期心肌细胞的发育，阻断原始肌管的形成。相反，增加GATA-4表达将加速心脏的发育，并明显增加分化末期搏动的心肌细胞数量[9]。本实验中，诱导分化14d后，实验组细胞GATA-4 mRNA的表达较对照组明显增高，但不足之处在于未动态监测多个时间点GATA-4 mRNA的表达水平。

目前，5-Aza作为一种促使间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导剂已得到确认，本研究通过5-Aza联合使用不同浓度apelin-13诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化，采用RT-PCR及免疫组化方法检测心肌细胞表面标志物cTnT和心肌早期转录因子GATA-4的表达，结果提示hUC-MSCs细胞均已向心肌定向分化，并表达心肌特异性蛋白cTnT。加入不同浓度apelin-13后cTnT、GATA-4 mRNA的表达均明显高于对照组。Zeng等[8]研究结果提示，apelin mRNA过表达和缺乏均影响心脏发育，表明合适浓度的apelin才会促进心脏前体细胞到达生心区促进心脏发育。本研究结果显示，3个不同apelin-13浓度组中，2×10－6mol/L apelin-13促进5-Aza诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化的能力最强，与Zeng等的观点一致。Wang等[2]在实验中发现，0.1×10－6、0.5×10－6mol/L的apelin-13分别是促进鼠、人胚胎干细胞向心肌分化的最合适浓度，与本实验的最优浓度2×10－6mol/L有差别，说明不同的细胞以及不同的培养体系中apelin-13的最优浓度存在差异，这可能与apelin影响心肌分化的机制有关。首先apelin作为趋化因子，可招募和增强心脏中胚层祖细胞聚集，Scott等[7]研究表明，过多或过少的apelin表达都会扰乱内源性趋化因子梯度，进而导致心脏祖细胞迁移失败。其次，apelin/APJ可能是以自分泌的形式参与心肌形成的[3-4]。Ashley等[10]发现小鼠胚胎心肌中有apelin/APJ mRNA和蛋白表达，且其表达贯穿心脏发育的全过程，而在成体小鼠心肌中只有APJ的表达，提示不同来源的间充质干细胞可能自分泌不同量的apelin参与心肌形成。D'Aniello等[11]的研究提示apelin/APJ信号通路作为Cripto/Smad2下游的效应因子，通过激活细胞外调控激酶(ERK)调控心肌细胞特异分化。但是目前apelin影响心肌细胞分化的具体机制仍未阐明。

为探讨较高浓度的apelin-13对hUC-MSCs是否有毒性作用，本研究采用10×10－6mol/L apelin-13处理细胞24h，并用MTT法检测细胞在570nm处的A值，结果表明该浓度的apelin-13对细胞无毒性作用，为此后用2×10－6mol/L的apelin-13联合5-Aza诱导hUC-MSCs向心肌细胞分化提供了实验依据。

综上所述，10×10－6mol/L apelin-13对hUCMSCs无明显毒性作用，一定浓度的apelin-13蛋白可促进5-Aza诱导华通胶间充质干细胞向心肌细胞的分化，浓度为2×10－6mol/L时促进作用最明显。

再生医学可从根本上改善缺血性心脏病的预后，而心脏再生医学不仅需要寻求诱导干细胞向心肌细胞定向分化的关键因子，还需要选择具有临床应用前景的种子细胞。hUC-MSCs是一种明显较骨髓间充质干细胞更原始、增殖分化潜能更强、介于成体与胚胎干细胞之间的原始干细胞，且其能分泌表达APJ及apelin mRNA。因此，进一步研究apelin对hUC-MSCs向心肌细胞分化的影响及其机制，具有重要临床意义。

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Influence of apelin-13 on 5-azacytidine inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells to cardiomyocytes

XU Xiao-hong1, WANG Li2, ZHANG Ning-kun2, ZHENG Nan2, GAO Liao-ru2, ZHU Zhi-ming2*
1Affiliated Clinical Faculty of Navy General Hospital, Anhui Medical University, Beijing 100048, China
2Department of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: xujilong18@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170094)

ObjectiveTo explore the influence of apelin-13 on 5-azacytidine (5-Aza) inducing differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) to cardiomyocytes. MethodshUC-MSCs were cultivated by tissue adherent method, and subcultured after digested with trypsin. The second passage cells (P2) were cultured for 14 days with different concentrations of apelin-13 (0, 1×10–6mol/L, 2×10–6and 10×10–6mol/L apelin-13, called as group A, B, C and D respectively), and the concentration of 5-Aza was 10×10–6mol/L in each group. Immune markers on the surface of hUC-MSCs were detected by flow cytometry, the absorbance (Avalue) of cultured cells at 570nm was detected by MTT method, the mRNA expression levels of troponin T (cTnT) and GATA-4 were determined by RT-PCR, and the expression of cTnT (myocardial cell surface marker) was observed by immunohistochemistry.ResultsHUC-MSCs expressed CD44, CD90, CD105, CD73 and HLA-ABC, but did not express CD34, CD45 or HLA-DR. TheAvalue at 570nm of hUC-MSCs treated with 10×10–6mol/L apelin-13 was 0.875±0.325 and similar to that of hUC-MSCs treated with 0 mol/L apelin-13 (0.841±0.290,P＞0.05). The expression levels of cTnT mRNA and GATA-4 mRNA in groups B, C and D were 2.09±1.35, 5.24±1.30 and 1.17±0.63 and 2.68±1.18, 4.82±0.14 and 2.14±0.27times those in group A. The expression levels of cTnT and GATA-4 mRNA in group C were significantly higher than those in groups B and D (P＜0.05). Immunohistochemical staining showed cTnT protein was positively expressed in group C after induction for 14 days.ConclusionsThere is no toxic effects of apelin-13 at concentration of 10×10–6mol/L on hUC-MSCs. Certain concentrations of apelin-13 could promote the 5-Aza inducing differentiation of hUC-MSCs to cardiomyocytes, especially at 2×10–6mol/L.

umbilical cord; mesenchymal stem cells; myocardium; cell differentiation; apelin-13; 5-azacytidine

R542.22

A

0577-7402(2013)10-0796-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.003

2013-05-17；

2013-06-24)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金(81170094)

徐小红，硕士研究生。主要从事干细胞的基础与临床研究

100048 北京 安徽医科大学解放军海军临床学院(徐小红)；100048 北京 海军总医院心脏中心(王力、张宁坤、郑楠、高连如、朱智明)

朱智明，E-mail：xujilong@126.com