骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压模型大鼠的作用

赵科研，王辉山，侯明晓，柳克祥，吴慧颖，李博

骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压模型大鼠的作用

赵科研，王辉山，侯明晓，柳克祥，吴慧颖，李博

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压模型大鼠的治疗作用。方法采用全骨髓贴壁法培养Wistar大鼠MSCs，取第3～5代细胞进行移植。健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为对照组、MCT组、MCT/MSCs 5×105组和MCT/MSCs 1×106组，每组10只。MCT经腹腔注射(60mg/kg)，MSCs经颈外静脉注射移植。4周后，测定大鼠右心室收缩压(RVSP)后处死大鼠，取心脏组织称取湿重计算心室比(即右心室与左心室＋室间隔的质量比)；取肺组织行HE染色、地衣红染色和平滑肌actin免疫组化染色观察。结果MSCs颈外静脉移植4周后，MCT/MSCs 1×106组RVSP为35.6±8.4mmHg，心室比为0.357±0.092，均明显低于MCT组(分别为47.2±10.5mmHg、0.445±0.094，P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105组的RVSP和心室比分别为42.5±11.3mmHg、0.400±0.073，与MCT组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。肺组织病理染色可见MCT/MSCs 1×106组肺小动脉中膜厚度(19.2%±3.8%)明显低于MCT组(26.4%±4.9%，P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105组(23.3%±3.6%)与MCT组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论MSCs颈外静脉移植对MCT诱导的肺动脉高压具有治疗作用，单次移植细胞数量达1×106个可获得较好的治疗效果。

间质干细胞移植；野百合碱；高血压，肺性

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是常见的心血管疾病，主要特征为肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高，最终导致患者右心衰竭而死亡，其病因复杂，诊断及治疗较为困难。虽然目前一些药物可暂时降低肺动脉压力，改善PAH患者的运动耐力和生活质量，但其效果无法持久。有学者尝试采用内皮祖细胞、内皮样祖细胞和基质干细胞等移植，以再生健康的内皮细胞治疗PAH，获得了初步疗效[1-2]。野百合碱(monocrotaline，MCT)是豆科植物野百合中提取的生物碱，具有细胞毒性作用，其代谢产物通过肺脏时沉积于肺小动脉壁及肺毛细血管，导致肺血管损伤，破坏肺组织内皮细胞等，最终形成PAH，故常用于制作PAH动物模型[3-5]。本研究采用MCT建立PAH动物模型，观察了骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)静脉移植对PAH的治疗作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠，3周龄，体重60～70g，成年雄性Wistar大鼠40只，体重180～250g，均由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 主要仪器及试剂 全自动显微镜数码摄像系统(Olympus，日本)，多功能病理图像分析仪(同济)，BL-420E＋生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)。低糖DMEM培养基、特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司，美国)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29-Alexa Fluor、小鼠抗大鼠CD45-FITC(Biolegend公司，美国)，小鼠抗大鼠CD44-PE、小鼠抗大鼠CD34-FITC(Santa Cruz公司，美国)，平滑肌actin免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分离、培养和鉴定 清洁级雄性Wistar大鼠幼鼠断颈处死，乙醇浸泡15min，无菌条件下分离股骨、胫骨，DMEM培养液冲洗骨髓腔；洗涤后的沉淀以含10%胎牛血清的DMEM混悬，接种于100ml培养瓶中，5%CO2、37℃下培养，24～48h后换液，每2～3d更换一次培养基，相差显微镜下观察，待细胞80%融合后以0.25%胰酶消化，计数并传代。收获第3代细胞，CD29-Alexa Fluor、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-FITC鉴定，流式细胞仪检测。取3～5代MSCs以含EDTA的0.25%胰酶消化，PBS冲洗，PBS悬浮细胞(1000个/μl)，置于冰上直至移植开始。

1.2.2 动物分组 40只成年雄性Wistar大鼠随机分为4组(n=10)：对照组、MCT组、MCT/MSCs 5×105组、MCT/MSCs 1×106组，后三组大鼠经腹腔注射MCT 60mg/kg，对照组注入等量盐水。全麻后固定，颈部正中切口切开并游离右侧颈外静脉，1ml注射器给予MSCs(MCT组和对照组给予等量PBS)，4周后进行测压、取材。

1.2.3 大鼠右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)测量 移植后4周，暴露大鼠右颈外静脉1cm，采用3F婴幼儿穿刺鞘管(美国Cook公司)由颈外静脉经前腔静脉、右心房缓慢推入右心室，根据压力波形观察测定RVSP。

1.2.4 大鼠心室比测定 测量RVSP后处死大鼠，取出心脏，沿房室沟剪除心房组织，沿室间隔右心室边缘分离右心室，用滤纸吸去血液，称湿重，计算心室比，即右心室与左心室＋室间隔的质量比，并以此作为衡量右心室肥大的指标。

1.2.5 大鼠肺组织形态学观察 大鼠处死后由主支气管灌注中性甲醛固定缓冲液，使肺组织膨胀固定20min，然后切下肺组织浸泡于中性甲醛溶液中，48h后取材制作石蜡切片，厚约5μm，每个肺组织标本取5支肺泡水平肺小动脉，行HE染色、平滑肌actin免疫组化染色和弹力纤维地衣红染色。弹力纤维染色图片采用200倍光镜观察，采集图像后分别测定内、外弹力板的平均直径，根据公式计算中膜厚度百分比(WT%)[6]。WT%=(2×WT/ED)×100%。其中WT为中膜厚度，ED为血管外径。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MSCs培养及鉴定结果 骨髓细胞接种于培养瓶后6～8h可见间充质干细胞贴壁，呈圆形或多角形；2～3d后可见细胞呈短梭形、短棒状或星形；6～7d见细胞呈集落状生长，放射状排列；约14d细胞几乎长满培养皿底，呈鱼群、旋涡状分布。传代后的细胞生长迅速，多为梭形，贴壁快，24h便可全部贴壁、伸展，呈均匀分布、增殖；3～4d可见细胞融合生长为单层。第3代MSCs表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6%、78.2%、0.0%、0.3%。

2.2 移植后RVSP及心室比的改变 移植后4周，与对照组比较，其余3组RVSP及心室比均明显增加(P＜0.05)。与MCT组比较，MCT/MSCs 1×106组RVSP及心室比均明显下降(P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105组RVSP及心室比下降不明显(P＞0.05，表1)。

表1 移植后4周各组大鼠RVSP、心室比及肺小动脉中层厚度变化±s，n=10)Tab. 1 Changes of RVSP, ventricular ratio and media thickness of pulmonary artery 4 weeks after transplantation±s,n=10)

表1 移植后4周各组大鼠RVSP、心室比及肺小动脉中层厚度变化±s，n=10)Tab. 1 Changes of RVSP, ventricular ratio and media thickness of pulmonary artery 4 weeks after transplantation±s,n=10)

RVSP. Right ventricular systolic pressure; Ventricular ratio. Mass ratio of right ventricle to left ventricle and ventricular septum; MTPA. Media thickness of the pulmonary arterioles. (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with MCT group

GroupRVSP(mmHg)Ventricular ratioMTPA(%) Control25.2±4.00.235±0.02110.1±1.1 MCT47.2±10.5(1)0.445±0.094(1)26.4±4.9(1)MCT/MSCs 5×10542.5±11.3(1)0.400±0.073(1)23.3±3.6(1)MCT/MSCs 1×10635.6±8.4(1)(2)0.357±0.092(1)(2)19.2±3.8(1)(2)

2.3 移植后肺组织病理学变化

2.3.1 HE染色 对照组肺动脉管壁菲薄，内皮细胞扁平连续，细胞分布均匀，大小厚薄较一致。MCT组肺小动脉壁增厚伴玻璃样变，管腔狭窄甚至闭塞，大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主；小血管壁正常结构丧失，有纤维素样渗出，管周有淋巴细胞浸润，肺泡壁上毛细血管淤血，肺间质增厚。MCT/MSCs 1×106组与MCT组相比弹力纤维变薄，而MCT/MSCs 5×105组亦变薄，但不及MCT/ MSCs 1×106组明显(图1)。

图1 肺组织HE染色Fig. 1 HE staining of lung tissue

2.3.2 平滑肌actin免疫组化染色 对照组肺小动脉中层平滑肌厚度很薄；MCT组中层平滑肌明显增厚；MCT/MSCs 1×106组及MCT/MSCs 5×105组中层平滑肌均较MCT组变薄(图2)。

图2 肺组织平滑肌actin免疫组织化学染色Fig. 2 Actin histochemical staining of smooth muscle in lung

2.3.3 弹力纤维染色 对照组肺腺泡内小动脉内外弹力板(花边样)呈深棕色，中层不增厚，管腔无狭窄；MCT组中层增厚，管腔狭窄；与MCT组相比MCT/MSCs 5×105组及MCT/MSCs 1×106组中层变薄，后者更为明显(图3)。图像定量分析显示，对照组肺小动脉中层厚度百分比明显低于其余3组(P＜0.05)。与MCT组比较，MCT/MSCs 1×106组中层厚度明显变薄(P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105组与MCT组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

图3 肺组织地衣红染色Fig. 3 Orcein staining of lung tissues

3 讨 论

临床上PAH的诊断标准为静息时平均肺动脉压力＞25mmHg 或运动时＞30mmHg，右心导管是诊断和评估治疗反应的金标准，同时还应排除左心系统疾病[6]。内皮细胞受损是PAH发生的主要机制，为了再生健康的内皮细胞，研究人员采用成体干细胞移植的方法进行了尝试。

干细胞治疗PAH的可能机制包括以下两个方面。①干细胞整合到肺动脉内皮层：相对于其他脏器，肺微血管在解剖上是一种天然的生理性滤器，相对较大的粒子如悬浮细胞会定植于肺的微血管，因此在理论上对肺血管进行细胞移植可能取得较其他脏器更好的效果[7]。Ortiz等[8]认为骨髓间质细胞可以定植于博莱霉素损伤的肺组织，并可分化呈上皮细胞样形态，减轻肺部炎症和胶原沉积。研究显示，移植的骨髓间质细胞在肺组织中长期存在，表现出高度的可塑性，并可保留其分化能力[9-12]。移植的内皮祖细胞(EPCs)可整合到PAH模型大鼠的肺小动脉和毛细血管中并分化为成熟的内皮细胞[2,13]。②干细胞具有刺激组织新生血管的能力，可以通过自分泌或旁分泌作用，降低肺动脉阻力。Baber等[14]对PAH模型大鼠进行研究发现，气道移植MSCs后，肺血管对乙酰胆碱扩张剂的反应性增强，考虑是由于移植到肺实质中的干细胞虽未融合到血管，但可通过内分泌作用改善血管内皮功能，使侧支血流轻度增加。EPCs既能融合到新生血管，又能刺激固有的血管功能，这是其能够刺激血管新生和内皮修复的关键[15]。

目前关于移植骨髓间充质干细胞治疗PAH的报道较少。移植人脐带血来源的EPCs可中度减轻MCT诱导的PAH(肺血管阻力下降16%)，使肺动脉压力下降14%[14]。本研究结果显示，MSCs静脉移植可减轻MCT导致的肺动脉压力升高，1×106个MSCs可明显降低RVSP，减轻肺动脉压力升高导致的右心室肥厚，且肺小动脉中层厚度变薄，具有明显的治疗作用，其效果优于5×105个MSCs移植。何志旭等[16]也进行了MSCs治疗PAH的研究，采用5×106个MSCs通过舌下静脉移植，结果28d后移植MSCs的大鼠RVSP、右心指数均较MCT组降低，获得了较好的效果。本研究采用的是中心静脉(颈外静脉)途径移植，可能最终到达并定植于肺组织的细胞数目有所不同，其中的差别还需进一步研究。

综上所述，MSCs静脉移植是治疗PAH的一种可尝试的良好方法，可用于各种原因导致的PAH，还可进行转基因以增强治疗效果，但其具体机制及对不同严重程度PAH的疗效尚需进一步深入研究。

[1] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J]. Nature, 2002, 418(6893): 41- 49.

[2] Zhao YD, Courtman DW, Deng Y,et al. Rescue of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension using bone marrow-derived endothelial-like progenitor cells[J]. Circ Res, 2005, 96(4): 442-450.

[3] Hayashi Y, Hussa JF , Lalich JJ. Corpulmonale in rats[J]. Lab Invest, 1967, 16(6): 875-880.

[4] Sun JH, Chen LX, Chen LF. Effects of ramipril on nitric oxide concentration and endothelial nitric oxide synthase activation in lung of rats with pulmonary arterial hypertension induced by monocrotaline[J]. Med J Chin PLA, 2009, 34(5): 583-586.[孙金华, 陈丽星, 陈兰芳. 雷米普利对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中一氧化氮和内皮型一氧化氮合酶活性的影响[J]. 解放军医学杂志, 2009, 34(5): 583-586.]

[5] Yang DL, Li XH, Zhang HG,et al. GCIP-27 inhibits the development of pulmonary hypertension in monocrotalinetreated rats[J]. Med J Chin PLA, 2008, 33(12): 1431-1433.[杨丹莉, 李晓辉, 张海港, 等. G蛋白竞争性抑制肽GCIP-27对野百合碱所致肺动脉高压影响的研究[J]. 解放军医学杂志, 2008, 33(12): 1431-1433.]

[6] Society of Cardiology, Chinese Medical Association. Editorial Board of Chinese Journal of Cardiology. Experts consensus of diagnosis and treatment in pulmonary arterial hypertension[J]. Chin J Cardiol, 2007, 35(11): 979-987. [中华医学会心血管病学分会, 中华心血管病杂志编辑委员会. 肺动脉高压筛查诊断与治疗专家共识[J]. 心血管病杂志, 2007, 35(11): 979-987.]

[7] Campbell AIM, Kuliszewski MA, Stewart DJ. Cell-based gene transfer to the pulmonary vasculature endothelial nitric oxide synthase overexpression inhibits monocrotaline-induced pulmonary hypertension[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999, 21(5): 567-575.

[8] Ortiz LA, Gambelli F, McBride C,et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(14): 8407-8411.

[9] Grove JE, Lutzko C, Priller J,et al. Marrow-derived cells as vehicles for delivery of gene therapy to pulmonary epithelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2002, 27(6): 645-651.

[10] Kotton DN, Ma BY, Cardoso WV,et al. Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium[J]. Development, 2001, 128(24): 5181-5188.

[11] Fang X, Tang BX, Zhang ML,et al. Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplatation on pulmonary emphysema rats[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2010, 45(4): 395-398.[方翔, 汤兵祥, 张曼林, 等. 骨髓间充质干细胞移植对肺气肿大鼠的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2010, 45(4): 395-398.]

[12] Sheng M, Huang HG. Mechanism of effects of mesenchymal stem cells on acute pancreatitis and lung injury[J]. Med J Chin PAPF, 2011, 22(10): 903-906.[盛闽, 黄鹤光. 骨髓间充质干细胞对急性胰腺炎与肺损伤作用机制的研究[J]. 武警医学, 2011, 22(10): 903-906.]

[13] Nagaya N, Kangawa K, Kanda M,et al. Hybrid cell-gene therapy for pulmonary hypertension based on phagocytosing action of endothelial progenitor cells[J]. Circulation, 2003, 108(7): 889-895.

[14] Baber SR, Deng W, Master RG,et al. Intratracheal mesenchymal stem cell administration attenuates monocrotaline-induced pulmonary hypertension and endothelial dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(2): H1120-H1128.

[15] Ward MR, Stewart DJ, Kutryk MJ. Endothelial progenitor cell therapy for treatment of coronary disease, acute MI, and pulmonary arterial hypertension: current perspectives[J]. Catheter Cardiovasc Interv, 2007, 70(7): 983-998.

[16] He ZX, Wang HW, Shang F,et al. Hemodynamic parameter changes in pulmonary arterial hypertension treated by transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in experimental rats[J]. J Appl Clin Pediatr, 2009, 24(1): 14-17. [何志旭, 汪浩文, 尚峰, 等. 骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压大鼠血流动力学指标的变化[J]. 实用儿科临床杂志, 2009, 24(1): 14-17.]

Therapeutic effect of mesenchymal stem cells transplantation on pulmonary hypertension model rats

ZHAO Ke-yan1, WANG Hui-shan1, HOU Ming-xiao1, LIU Ke-xiang2, WU Hui-ying2, LI Bo2
1Department of Cardiovascular Surgery, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China
2Department of Cardiovascular Surgery, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, China
This work was supported by the "Eleventh Five-Year Plan" Medical and Health Research Foundation of PLA (08G004)

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation on monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertension in rats.MethodsMSCs were isolated from Wistar rats and cultivated by bone marrow adherent culture. The third to fifth passages of MSCs were used for cell transplantation. Forty male Wistar rats were randomly divided into control group, MCT group, MCT/MSCs 5×105group and MCT/MSCs 1×106group (10 each). MCT was injected intraperitoneally (60mg/kg), and MSCs were transplanted into rats through external jugular vein. Right ventricular systolic pressure (RVSP) of rats was determined, then the animals were sacrificed and the ventricular ratio (i.e. the mass ratio of right to left ventricle plus interventricular septum) was calculated. The lung tissue was observed by light microscopy after HE staining, orcein staining and smooth muscle actin immunohistochemical staining.Results Four weeks after MSCs administration, the RVSP and ventricular ratio were 35.6±8.4mmHg and 0.357±0.092 in MCT/MSCs 1×106group respectively, and significantly lower than those in MCT group (47.2±10.5mmHg and 0.445±0.094, respectively,P＜0.05), while the RVSP and ventricular ratio were 42.5±11.3mmHg and 0.400±0.073 in MCT/MSCs 5×105group, and no statistical difference was found when compared with MCT group (P＞0.05). Pathological observation found the intima-media thickness of pulmonary arterioles was 19.2%±3.8% in MCT/MSCs 1×106group, and significantly thinner than that in MCT group (26.4%±4.9%,P＜0.05), while it was 23.3%±3.6% in MCT/MSCs 5×105group and no significant difference was found when compared with MCT group (P＞0.05).ConclusionIntravenous MSCs administration could inhibit the MCT-induced pulmonary hypertension and 1×106is the optimal number of MSCs for transplantation.

mesenchymal stem cell transplantation; monocrotaline; hypertension, pulmonary

R541.5

A

0577-7402(2013)10-0830-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.010

2012-12-03；

2013-08-21)

(责任编辑：胡全兵)

全军“十一五”医药卫生科研基金(08G004)

赵科研，医学博士，主治医师。主要从事复杂先心病及肺动脉高压的临床治疗工作

110016 沈阳 沈阳军区总医院心血管外科(赵科研、王辉山、侯明晓)；130041 长春 吉林大学第二医院心血管外科(柳克祥、吴慧颖、李博)