阻抗特性评价猪肉的新鲜度

石丽敏，黄 岚，梁志宏,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学信息与电气工程学院，北京 100083)

新鲜度是评价冷鲜猪肉质量的最重要的指标之一，目前学者已经研究了一系列的指标和方法来评价冷鲜猪肉的新鲜度，如感官评价法、物理及化学评价法、微生物评价法、电子鼻、光谱法、计算机视觉技术等新型评价法[1]。感官评价方法，主要是专业人员通过观察肉的表面和切面的状态、色泽、黏度、弹性和气味、组织状态、滋味等判定肉的腐败程度，但具有一定主观性，对初期变质肉，难以得出正确结论[2]，常用化学方法辅助判断；化学方法是对挥发性盐基氮(TVB-N)、三甲胺、粗氨、pH值、硫化氢、肌红蛋白等测定[1,3-4]，其中国家标准以检测TVB-N作为反映新鲜程度的一个重要指标，但化学方法操作复杂费时且对样品造成破坏；微生物检测可利用国标法确定细菌菌落总数、一般检验法和鲜肉压印片镜检法，但现有的微生物检测费时费力，过程繁琐，检测周期长[4]，以上传统的方法都不适用于冷鲜猪肉的快速无损检测。近几年，新发展的快速检测方法，如电子鼻[5-6]在实验条件下能够反映肉的新鲜度且不破坏肉组织[7]；光谱学方法具有快速无损使用方便的特点，而受到到关注[8]；新型研究的PCR技术[9]检测细菌总数虽然可短时间内完成检测，取样量少但易污染；基于计算机视觉技术，可通过人工神经网络初步建立了模型分析评价猪肉新鲜度达到较高准确率[10]，但预测模型的代表性受到猪品种、饲养情况和屠宰等因素影响。为了适应实际需要，可多种快速检测方法进行肉品新鲜程度判断方法，保证测量准确性又可以快速给出综合评价结果。本研究将利用肉组织的电特性[11]对猪肉新鲜度进行快速评价。

生物阻抗是生物组织的一个基本的物理参数，反映生物组织、器官、细胞或整个生物机体电学性质。近年来，生物阻抗分析作为一种快速和非破坏性的方法已用于肉品成熟期品质因素的分析，并尝试通过肉品阻抗分析技术来分析肉品脂肪、水分等品质因素[12-13]。目前，生物阻抗技术在鱼肉中的研究较多，国外学者Martinsen Φrjan等[14]用EIS和四电极方法在1Hz～100kHz内研究黑线鳕肌肉的电特性，得出鱼死后肌肉的电特性发生较大变化；国内张军等[15]采用混合式电极在激励频率为591Hz条件下测量的阻抗随时间变化规律性强，建立了鱼体阻抗特性与化学指针TVB-N的数学模型，预测鱼肉的腐败状况。在猪肉中的研究，国内学者宋华宾等[11]采用电导率与TVB-N建立模型评价新鲜度，但实验对象是提取肉浸液，对肉本身造成破坏需要对样品进行取样和前处理，且肉浸液制备比较繁琐，需要辅助设备。

国外学者研究肉组织贮存过程时，分析了肌肉细胞膜的结构逐渐分解时的1Hz～1MHz范围内的电阻抗变化[16]。Castro-Giráldeza等[17]采用大型电阻抗分析仪器Agilent 4194A研究了屠宰后猪背最长肌4℃条件下贮藏的168h内，140Hz、1kHz、300kHz频率的阻抗变化与K-Value高度相关(K值，一个反映新鲜程度的指标)。TVB-N是我国国家标准反映肉新鲜程度的指标，研究贮存过程TVB-N、微生物变化与猪肉阻抗变化关系是可行的。这种方法可在货架内快速检测肉的新鲜程度，以避免贮藏不当引起的加速腐败的发生。本研究以生物阻抗理论为基础，以冷鲜猪肉为试样，采用四电极结构的便携式阻抗仪器，建立基于阻抗特性的冷鲜猪肉新鲜度快速检测方法，提高检测速率，为市场检测大批量冷鲜猪肉新鲜度提供可参考方法，利用阻抗特性预测猪肉新鲜度具有很好的应用前景。

猪肉如同其他生物组织一样含有大量形态各异的细胞，各细胞间的液体可视为电解质，因此当直流电或者低频电流施加于生物组织时，电流将以任意一种可能的方式绕过细胞，主要流经细胞外液；当施加于生物组织的频率增加，细胞膜电容的容抗减小，一部分电流穿过了细胞膜流经细胞内液[18]。所以生物组织的低频电阻抗较大而高频电阻抗较小，电阻抗值由大到小的过渡恰好反映了生物组织细胞膜的电容性质，生物组织的这种特性最早被Philipso所认识，并提出了等效电路的概念。

生物组织内单个细胞的等效电路模型如图1a所示，其中，Re是细胞外液的电阻/Ω；Ce是细胞外液的并联电容/F；Rm是细胞膜的电阻/Ω；Cm是细胞膜的并联电容/F；Ri是细胞内液的电阻/Ω；Ci是细胞内液的并联电容/F。细胞膜的漏电阻Rm很大，可视为开路，而细胞内外液的并联电容Ci、Ce在低频范围内(低于1MHz)很小，也可视为开路，这样就可以得到如图1b所示的简化等效电路模型，此模型又被称为并联等效电路模型。对于整个生物组织而言，由于生物组织是由大量的细胞组成，可视为许多细胞的集合，因此生物组织的电路模型也可用图1b所示的电路等效，只是此时的Ri、Re、Cm已不再是代表某个细胞内、外液电阻和细胞膜电容，而是代表整个生物组织的等效内、外电阻和膜电容，这就是所谓的三组件生物电阻抗模型[14,19]。

图 1 R-C三组件生物电阻抗模型Fig.1 R-C bioelectricity impedance model with three components

其中，

Cole-Cole模型是早在1941年由Cole K S和Cole R H提出，阻抗Z*是交流频率f复函数，公式如下：

式中：Zreal是阻抗实部；Zimag是阻抗虚部；i=(－1)1/2。

Cole-Cole理论证实了实际的生物其阻抗轨迹在复平面内不是一个半圆，而是第4象限的一段圆弧，所以，三元件模型及复阻抗方程仅是对生物阻抗的近似，由此提出了Cole-Cole复电阻方程，同时每个频散(如β频散)都可以应用于此方程，方程式为[21-22]式(4)。

式中：ω=2πf，R0代表频率为0处的电阻抗；R∞代表频率无穷大的电阻抗；τ代表时间常数；α是弛豫因子，为无量纲指数，用于校正电解质损失引起的膜电容特征变化，反映了频散分布，一般在0～1间取值，其大小决定圆心的位置，而当α=0时，其复阻抗轨迹即为三元件模型的复阻抗轨迹，位于第4象限的一个半圆，圆心在实轴上。

图2所示的Cole-Cole阻抗圆，横坐标为实部阻抗，纵坐标为虚部阻抗，Pi为生物组织在某一频率下地生物电阻抗值。Zi(ωi)代表阻抗幅值，r代表圆半径。

图 2 阻抗圆Fig.2 Impedance chart

基于Cole-Cole理论，Schwan通过对生物组织频率特性的研究及大量实验证明，生物组织内存在3个不同的频率散，分别称为α、β和γ频散[23-25]，生物组织的介电常数和电阻率随着频率变化有3个明显的散射区域，其中α频散主要发生在音频频段(几赫兹到几十千赫兹)，是由于包围组织内细胞离子层发生变化引起的，表现为细胞膜电容发生变化；β频散主要发生在射频频段(几十千赫兹到几十兆赫兹)，主要由膜电阻的容性短路和生物高分子的旋转松弛所引起，在此频段内，细胞膜电容基本恒定。在音频和射频频段内，随着频率增加，膜电容的容抗减小，电流在低频时绕过细胞膜只流经细胞外液，到高频时穿过细胞膜流经细胞内、外液，因此表现为电导系数随频率升高而增大，相反介电系数随频率升高而减小。γ频散主要发生在微波频段(几十兆赫以上)，是由于蛋白质和蛋白质结合的水在电场作用下分子的偶极转动所引起。由此可见，在音频频段和射频频段对生物组织介电特性的研究可以同时反映出细胞内液和外液的特征。

“生物阻抗谱”是系列频率下的生物阻抗值，根据三元件模型可知，生物阻抗谱中不仅反映肉品中细胞间和细胞内电解质的变化(电阻)，还反映细胞结构的信息(电容)，即反映了肉品品质的信息[26]，也携带了结构变化的信息[16-17]，肉品新鲜度与细胞结构变化有密切关系，当细胞膜破裂或者溶解时，会导致肉品等效电容发生变化。如何建立生物阻抗谱与品质分析的定量模型国内杨洋[27]做了研究。本研究重点在于探讨猪肉阻抗谱与新鲜程度变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

采用冷鲜猪肉为试样，样品来自新程金锣肉制品有限公司屠宰厂区。样品采用灭菌保鲜袋包装后置于4℃冰箱贮藏。自2011年9—10月进行2组实验，每组实验分别取(4.0±0.2)kg猪后臀尖瘦肉，标记为1、2组，再把样品分割成8块(0.50±0.05)kg的肉样，编号并置于4℃保藏，用于实验研究。另取两组标号3、4，按上述方法分割肉样后，每组样品4块肉样品置于4℃贮藏，另外4组置于室温(25℃)1d加速腐败程度，后置于4℃冰箱贮藏，用于实验研究。

1.2 方法

采用CAUBM-2型肉品阻抗测量仪器[28](中国农业大学信息与电气工程学院近红外光谱分析实验室提供)，仪器在0.1～250kHz范围内自动扫频，阻抗精度±2%，相位范围，－90°～+90°，显示复阻抗随频率变化图及相位随频率变化图，可以计算出生肉Cole-Cole模型的特征参数，如Re、Ri、Cm、α及τ等。可以使用四针式电极进行阻抗测量直至猪肉腐败；实验同时测量猪肉的TVB-N含量、细菌菌落来判断猪肉的腐败，同时测定水分含量和脂肪含量辅助分析。

1.2.1 阻抗测定

从1、2、3、4号猪肉中各取一个肉样进行检测，用CAUBM-2型肉品阻抗测量仪器的电极探头垂直插入每个样品在不同部位，测量3次，求其平均；连续检测8d，共检测8次；环境温度在(23±2)℃。

1.2.2 传统检测方法的测定

蛋白质、脂肪和水分含量的常规检测分别是凯氏定氮仪、索氏抽提法和恒温干燥法[29]，另外细菌菌落总数采用国标法测定。

1.2.2.1 TVB-N含量的测定

用绞肉机将猪肉后臀尖绞碎搅匀，精确称量10.0g，置于锥形瓶中，加100mL蒸馏水，不时振荡，浸渍30min后过滤，样品经过滤后置于冰箱备用；将盛有10mL 20g/L硼酸吸收液及6滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收管液面下，准确吸取5.0mL肉样滤液于蒸馏器反应室内，加5mL 10g/L氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏5min即停止，吸收液用0.010mol/L盐酸标准液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白实验[30]。

1.2.2.2 细菌菌落总数的测定用灭菌剪刀在无菌环境下尽量将肉样剪碎，称取25g样品置于225mL生理盐水的无菌三角瓶中，振荡均匀，10倍系列梯度稀释，选取适宜梯度2个，吸取1mL样品匀液与无菌平皿中，每个梯度做2个平皿，同时做空白对照，及时将15～20mL的平板计数琼脂培养基倾注平板，转动混匀，36℃培养48h[31]。

1.2.2.3 脂肪的测定

将肉用绞肉机绞过2次，精确称取2g，全部移入滤纸筒内，将滤纸筒放入脂肪抽提器的抽提筒内，连接已恒质量的接受瓶，由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚至容积的2/3处，于45℃水浴加热，不断回流7h，结束后恒质量称量接受瓶，计算脂肪含量[32]。

1.2.2.4 水分的测定

将肉用绞肉机绞过2次，精确称取2g，置于恒质量的称量皿中，101℃干燥箱烘干4h，冷凝器冷却0.5h，继续101℃干燥箱烘干1h，冷却再称量，重复以上操作至恒质量，前后2次差值＜2mg[33]。

2 结果与分析

2.1 TVB-N含量、微生物、脂肪、水分含量对猪肉新鲜程度的影响

表1 未达到腐败水平时冷鲜猪肉贮藏过程中的各项指标Table 1 Some indexes of chilled pork before reaching spoilage levels

国家标准以TVB-N作为评价猪肉新鲜程度的重要指标，TVB-N是外界微生物侵染肉品及肉本身含有的微生物分泌酶引起的脱氨脱羧等作用使蛋白质分解形成的碱性物质，主要是含氨以及少量胺类等组分。随着贮藏时间的增加，TVB-N的含量会呈现上升趋势，实验中的TVB-N含量对于测定值如表1所示，根据国家标准[34]可知，TVB-N含量＜15mg/100g时为新鲜肉，15mg/100g＜TVB-N含量＜25mg/100g时为次鲜肉，TVB-N含量＞25mg/100g标志着猪肉已腐败。

细菌菌落总数作为反应食品被污染程度的标志，也能够一定程度上反映出食品的新鲜程度，具有重要的卫生学意义，虽然目前没有标准规定微生物的具体数量范围来确定新鲜度的分级情况，但大量的实验性研究表明，当细菌菌落总数＞106CFU/g时也已出现腐败状况[35]，菌落总数＞108CFU/g建议不再食用。

肉在腐败过程中微生物作用于脂肪酶使之分解生成脂肪酸、甘油、醛、酮等化合物导致脂肪酸败[36]，脂肪的酸败速度与水分和微生物污染程度有关，水分越多污染程度越严重，特别是霉菌和分支杆菌的繁殖，会产生大量的解脂酶。温度较高时会增加脂肪的水解。

水分是猪肉组成中的重要成分，水分含量及其持水性关系到肉的组织形态、品质及风味，随着猪肉不断腐败，猪肉的保水性下降，使得水分大量流失。

2.2 阻抗特性对猪肉新鲜程度的影响

生物组织的电阻抗主要取决于组织内体液的含量，细胞膜的活性，细胞内外电阻率的分布以及广泛存在的分布电容。由于猪肉的组织微观结构复杂导致电阻特性趋于复杂化，多种因素的共同作用使得生物组织阻抗整体上表现接近于一个复杂的电路网络。在这个复杂电路网络中，细胞膜、细胞内外液会随着组织活性的变化发生显著的变化从而影响组织宏观的电阻抗谱特性[37]。Cm反映细胞膜的并联电容，冷鲜猪肉在贮藏过程中，猪肉中酶自溶，细胞膜被破坏，随着猪肉细胞膜的破损程度，Cm发生相应变化，猪肉随细胞膜损坏，细胞内能导电的容易让将在细胞间渗透，组织内的电阻Ri、Re也会随之发生变化。

本研究考虑了样品的选择和测试条件的控制，采用了屠宰排酸后的猪背最长肌、测试取顺着肌纤维纹理测试，保证测试的一致性。而且，实验中是对同一样品连续取样，脂肪含量等无显著差异，在本实验中可以忽略这些因素。

2.2.1 肉品达到次鲜但未达到腐败水平时冷鲜猪肉的变化

2.2.1.1 阻抗随时间的变化

图 3 未达到腐败水平时冷鲜猪肉的复阻抗谱图Fig.3 Complex impedance profi le of chilled pork before reaching spoilage levels

采用四电极式与冷鲜猪肉接触，信号源在0.1～250kHz之间时测得阻抗及TVB-N含量结果如表1所示，其中Cm反应膜容抗，呈现下降趋势与TVB-N含量呈负相关性，表明猪肉新鲜度下降，由于在此过程中细胞膜发生变化，导致容抗降低。肉品新鲜度变化的阻抗如图3所示，随着时间的推移(0～6d)，冷鲜猪肉肌肉颜色逐渐呈现暗红，略出现腥味，根据Cole-Cole模型理论，复阻抗虚部最小值所对应的点为特征频率fc[38]，如图3a所示，新鲜的冷鲜猪肉特征频率点在20kHz左右，随着时间的推移，冷鲜猪肉样品的特征频率点在频谱图上逐渐右移，且特征频率点所对应的复阻抗虚部的最小值也逐渐增大，第1天、第2天及第4天、第5天的复阻抗虚部频谱线在特征频率点分别在10kHz附近(10～30kHz)和20kHz(10～100kHz)附近分离比较明显，其他频率范围内基本重合，由此可见，特征频率点是评定肉品新鲜度的一个重要指标。图3b所示为阻抗实部值随肉品新鲜度变化的趋势图，随着肉品新鲜程度的降低，阻抗实部值逐渐降低，根据复阻抗的定义式可知肉品复阻抗值总体呈现下降趋势。

2.2.1.2 阻抗与TVB-N含量的相关性

采用四电极式与冷鲜猪肉接触，信号源在0.1～250kHz之间时测得阻抗结果及TVB-N含量变化如表1所示，将表1的数据进行线性回归，得出相关关系为：

1)Cm与T V B-N 含量的关系：T=－0.3 7 5 Cm+ 17.30(R2=0.719)；2)Ri与TVB-N含量的关系：T=－0.058R0+3.206(R2=0.669)；3)Re与TVB-N含量的关系：T=－0.068Re+21.44(R2=0.949)。

式中：Cm为电容/F；Ri、Re为阻抗幅值/Ω；T为TVB-N含量/(mg/100g)。

如表1所示，膜电容Cm随着冷鲜猪肉新鲜度的降低膜电容呈现明显的下降趋势，可以作为评价冷鲜猪肉新鲜程度的一个重要指标，其与国家规定的评价新鲜度的经典方法TVB-N含量评价法的相关性达到0.719，在冷鲜猪肉未达到腐败的状态时，细胞外液电阻和细胞外液电阻与猪肉新鲜度存在一定相关性，细胞外液阻抗与TVB-N含量相关性高达0.949。

2.2.2 肉品达到腐败水平时冷鲜猪肉的变化

2.2.2.1 阻抗随时间的变化

采用四电极式与冷鲜猪肉接触，信号源在0.1～250kHz之间时测得阻抗及TVB-N含量结果如表2所示，随新鲜度变化，膜容抗Cm与TVB-N含量呈现负相关，表明肉品腐败程度加大。随时间推移，冷鲜猪肉的肌肉颜色逐渐呈现发白，纹理模糊，出现严重腥味且弹性降低。

由图4可知，新鲜的冷鲜猪肉特征频率点在20kHz左右，随着时间的推移，冷鲜猪肉样品的特征频率点在频谱图上逐渐右移，且特征频率点所对应的复阻抗虚部的最小值也逐渐增大，且呈现消失的趋势，同样可以证明，特征频率点是评定肉品新鲜度的一个重要指标。如图4b所示，鲜肉和次鲜肉呈现一定下降变化趋势，但是腐败肉的图谱线发生较大变化，可能是因为肉在腐败过程中，由于酶自溶细胞膜受到破坏，膜电容作用减小，表2可以证明此观点，肉的保水能力降低，损失更多的水分，脂肪酸败，蛋白质降解，肉的组织特性发生改变，从而使得肉品的电物特性随之发生变化。

表2 腐败水平时猪肉贮藏过程中的各项指标Table 2 Some indexes of chilled pork after reaching spoilage levels

图 4 腐败水平时猪肉的复阻抗谱图Fig.4 Complex impedance profi le of chilled pork after reaching spoilage levels

2.2.2.2 阻抗与TVB-N含量的相关性

采用四电极式与冷鲜猪肉接触，信号源在0.1～250kHz之间时测得阻抗结果及TVB-N含量变化如表2所示，将表1的数据进行线性回归，得出相关关系为：

1)Cm与T V B-N 含量的关系：T=－0.4 2 6 Cm＋60.49(R2=0.934)；2)Ri与TVB-N含量的关系：T=－0.063Ri＋3.419(R2=0.748)；3)Re与TVB-N含量的关系：T=－0.127Re＋29.83(R2=0.056)。

式中：Cm为电容/F；Ri、Rm为阻抗幅值/Ω；T为TVB-N含量/(mg/100g)。

如表2所示，膜电容Cm随着新鲜度的降低膜电容呈现一定下降趋势，与次鲜肉规律一致，其与国家规定的评价新鲜度的经典方法TVB-N含量评价法的相关度高达0.934，所以次鲜实验和腐败实验证明膜电容可以作为判定冷鲜猪肉新鲜度指标。在猪肉达到腐败后，阻抗仍然与TVB-N含量存在一定相关性，但是细胞外液电阻相关性明显减弱，这可能跟细胞腐败后细胞完全破碎，内部细胞液完全渗漏到整个肉组织中，导致阻抗不稳定由于猪肉品种及猪不同组织存在一定差异性，若想确定肉品腐败的Cm的限值还需进一步研究。

3 结 论

3.1 CAUBM-2型肉品阻抗测量仪器，采用四电极与冷鲜猪肉接触方式，信号源在0.1～250kHz范围内自动扫描，分别对新鲜肉到次鲜肉的变化过程，及新鲜肉到腐败肉的变化过程完成快速非破坏性检测。实验结果表明，冷鲜猪肉在由新鲜到次鲜肉的过程中，复阻抗及复阻抗的实部值和虚部值都发生了规律性的变化，在次新鲜到腐败的过程中，复阻抗虚部值仍然呈现规律性变化，但是实部值发生较大改变，同时考虑到冷鲜猪肉的品种不同及其腐败过程中脂肪和水分含量的变化会对实验的结果造成一定的影响，想要达到定量的结果描述肉品腐败还需要更进一步的研究。

3.2 在冷鲜猪肉腐败过程中，电容Cm与TVB-N含量高度相关，相关性达0.934。在肉品达到次鲜水平时，肉的新鲜程度与Ri和Re也有较高相关性；在肉腐败程度较严重的情况下，新鲜度与Re无明显相关性，这可能与肉品腐败中酶自溶，细胞膜破坏，细胞内液渗透使得细胞外液电解质增加。

3.3 基于生物阻抗理论制作的阻抗测量仪器可以用于冷鲜猪肉的阻抗测量。

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