不同方式冻结后养殖大黄鱼肌肉理化特性在冻藏期间的变化

刘永固，娄永江，屠冰心，李流川

（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

近年来，随着育种技术的突破和网箱养殖技术的推广，大黄鱼产量不断上升，除一部分鲜销外，冷冻保藏是最主要的加工销售途径。但是由于生成大的冰晶，常规冷冻后的冻品在贮藏和解冻后品质下降比较严重。食品高压转换冷冻（high pressure shift freezing，简称PSF）是三大高压冷冻技术之一，它主要利用水的不同冰晶形态，获得不同的晶型，降低或者避免冰晶对食品组织的机械损伤[1]。1990年前后日本京都大学林力丸教授首先在冷冻过程中引入温度和压力这两个参数，不仅实现了快速冻结，而且有效地提高了冻品的质量。近年来，国内外学者对不同冷冻食品的PSF冰晶形成机理及其应用作了大量研究，如豆腐、猪肉、凝胶、土豆[2-5]。研究表明与传统冷冻（conventional air freezing，简称CAF）相比，PSF能更好的保留食品的微观结构，同时还能改善食品品质。但是，到目前为止仍未出现高压转换冷冻技术应用于工业生产的报道。本文以整条养殖大黄鱼为对象，主要研究三种不同方式冷冻后大黄鱼肌肉理化特性在冻藏期间的变化，为进一步实现超高压保鲜提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄鱼（Pseudosciaena croceas） 取自浙江某养殖场，一级鲜度，体长（24.3±1.60）cm，鲜重（332.63±15.23）g。洗净，沥干表面水分，真空包装后置于4℃冰箱中备用；Tris（三羟甲基氨基甲烷） 分析纯，阿拉丁试剂有限公司；牛血清蛋白 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酒石酸钾钠 分析纯，天津市永大化学试剂开发中心；二甲苯 分析纯，江苏彤晟化学试剂有限公司；中性树脂、苏木精 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

HPP.M1-600/5超高压处理设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；PL403电子分析天平 梅特-托利多仪器（上海）有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HM505E冰冻切片机 德国；OLYMPUS BX51正置荧光万能显微镜 日本；DeltaTRAK电子温度记录仪 美国；TA-XTplus质构仪 英国Stable Micro System公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冻结方法 CAF法冷冻：将真空包装好的大黄鱼置于-25℃环境中冻结，待中心温度至-20℃时立即取出放入-20℃冷库中冻藏。

PSF法冷冻：以无水乙醇与水的混合溶液（1∶1配制）注入高压腔内，当温度分别下降到-14℃（145MPa）、-18℃（205MPa）时，把真空包装好的大黄鱼放入介质中。然后以4MPa/s的速率分别升压至145、205MPa，分别保压30、75min后在10s内迅速卸压，卸压结束，立即从腔体内取出浸入-20℃循环冷却液中，待鱼体中心温度至-20℃时，移入-20℃冷库中冻藏。

1.2.2 组织切片的制作与观察 以1.2.1冻结的鱼体为样本，在鱼体中线以上靠近头部位置按纤维走向取1cm×1cm×1.5cm的肌肉样（鲜鱼采用液氮冻结），按刘世新[6]冰冻切片法，将样品切成厚度为15μm的薄片后，用改良Van-Gieson法（VG法）染色，再用中性树脂封片，置于OLYMPUS BX51显微镜上观察拍照。整个操作过程在-20℃环境中进行。

1.2.3 盐溶性蛋白含量的测定 取冻藏样品若干，流动水解冻，去包装袋后取鱼中线以上背部肌肉（n=3～5），参照万建荣[7]的方法提取盐溶性蛋白，并按双缩脲法测定蛋白含量。标准曲线如图1所示。

图1 蛋白含量标准曲线Fig.1 The standard curve of protein content

1.2.4 质构分析（Texture profile analysis，TPA） 取冻藏样品若干，流动水解冻，去包装袋后取鱼中线以上靠近头部的肌肉样，去皮，切成1.5cm×1.5cm×1cm小块。测定时质构仪探头型号选择P/50，测试前速度2mm/s；测试速度1mm/s；测试后速度1mm/s；压缩比60%；停留间隔时间5s；触发类型自动；触发力10g；数据采集速率200。测前将样品置于4℃冰箱1h，每组样品测定6次。

1.2.5 数据处理 采用Excel和SPSS 16.0软件进行统计学处理。

2 结果与分析

2.1 肌肉组织显微结构的变化

图2从横截面和纵截面两方面显示了养殖大黄鱼肌肉组织的显微结构，新鲜大黄鱼样品的横截面呈较完整和规则的圆形或多边形，纵截面中纤维间连接紧密，排列整齐，其原生质分布均匀。大黄鱼经三种不同方式冻结后，样品产生的冰晶大小及分布差异很大，组织结构均受到不同程度的破坏。CAF法冷冻后的样品肌肉组织内产生的冰晶大而少，且难以判断冰晶产生于细胞内还是细胞外（见图3（a））。145MPa、-14℃冷冻后的样品组织内产生的胞内冰晶小而多，分布均匀，肌纤维破坏程度小（见图3（b））。205MPa、-18℃冷冻后样品产生的冰晶更细，冰晶对肌纤维的破坏程度更小，肌纤维形状变化较大（见图3（c））。其原因在于CAF是一个相对缓慢的冻结过程，最大冰晶生成带时间较长，形成的冰晶体大。而在PSF中，压力快速解除时，鱼体内处于过冷态的自由水瞬间产生大量细小的冰晶。且研究表明，过冷度每超过1℃，冰晶核的形成速率将会增加10倍[8]。但是205MPa冻结时由于压力较高，处理时间较长，导致稳定蛋白质高级结构的非共价键（氢键、离子键、疏水相互作用等）遭到破坏，肌原纤维发生聚合。从常规冷冻样品肌肉纵截面的显微照片中仍然可以看到大的冰晶体留下的空洞（见图4（a）），而高压冷冻样品的肌纤维发生了轻微的断裂或者挤压，没有发现胞内冰晶（见图4（b、c））。3个月后PSF法冷冻的样品在微观结构上均没有明显改变。图5（b）与图3（b）相比，肌纤维内的冰晶体略有增大，肌纤维裂开。这是因为在冻藏过程中相互接触的细小冰晶聚集在一起，或者温度变动产生重结晶。图6（b）或图4（b）中肌纤维出现裂口也说明了这一点。而CAF冻结样品肌肉横截面呈片状，破损严重。因此，PSF可以大大减小冰晶体的尺寸，避免冰晶对鱼体肌肉组织造成严重的机械损伤，从而有利于提高冻品的品质。

图2 鲜鱼样品肌肉的显微照片（100×）Fig.2 Micrographs of unfrozen sample（100×）

图3 冷冻样品冻藏0d时，样品肌肉的横切显微照片（100×）Fig.3 Crosscut micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 0d（100×）

图4 冷冻样品冻藏0d时，样品肌肉的纵切显微照片（100×）Fig.4 Slitting line micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 0d（100×）

图5 冷冻样品冻藏90d时，样品肌肉的横切显微照片（100×）Fig.5 Crosscut micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 90d（100×）

图6 冷冻样品冻藏90d时，样品肌肉的纵切显微照片（100×）Fig.6 Slitting line micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 90d（100×）

2.2 盐溶性蛋白含量的变化

图7 盐溶性蛋白含量在冻藏期间的变化Fig.7 Changes of the salt extractable protein content during the frozen storage

大黄鱼肌肉在冻藏期间盐溶性蛋白含量的变化如图7所示。冻藏初期，PSF冻结样品的盐溶性蛋白含量分别为38.50mg/g（145PMa）、24.69mg/g（205MPa），均小于CAF冻结样品的98.65mg/g。这是因为压力较高或者处理时间较长时，蛋白质的三级或者四级结构发生不可逆改变，引起蛋白质变性，且压力越大，保压时间越长，变性程度越大。CAF法冻结样品冻藏2个月和3个月后，盐溶性蛋白含量均显著减少（p＜0.05）。冻藏结束以后，盐溶性蛋白含量从98.65mg/g下降到74.06mg/g，下降幅度为24.93%。一般认为这是由于在冻藏过程中蛋白质的部分结合水形成冰晶，导致蛋白分子中的侧链和侧链之间互相结合，形成超大分子的不溶性凝集体，引起蛋白质的不可逆变性。145MPa、-14℃和205MPa、-18℃冷冻后的样品在冻藏期间盐溶性蛋白含量均没有显著变化（p＞0.05），但是后者在冻藏3个月后有所增加，这与Valeria等[9]对黑鲈的研究结论相似。

2.3 质构特性的变化

图8 质构特性在冻藏期间的变化Fig.8 Changes of texture during the frozen storage

质构是评价鱼类等水产品肌肉品质的一个非常重要的指标，同时也是消费者评价肉类质量优劣的主要依据[10]。由图8可知，在冻藏期间，三种方式冻结的大黄鱼肌肉的硬度、弹性和咀嚼性均逐渐下降，不过较之CAF，PSF（205MPa）冷冻的样品弹性（b）和咀嚼性（c）均显著提高（p＜0.05），冻藏初期分别提高13.73%、26.75%，90d后分别提高18.66%、31.20%。这主要因为高压引起蛋白质的空间结构发生改变。研究表明，高压能够促使肌球蛋白变形，还可以抑制肌肉组织中的水解蛋白酶活性，继而影响鱼体肌肉的质构特性[11]。此外，PSF冷冻过程中产生细小的冰晶也有利于较小损伤。从图8中可以看出，冻藏初期145MPa、-14℃冷冻样品的硬度与新鲜样品相比没有显著变化（p＞0.05），90d后略高于CAF冷冻的样品，而205MPa、-14℃冷冻的样品的硬度显著提高（p＜0.05），90d后，硬度仍然比新鲜样品高。这可能与压力及时间有关。雒莎莎等[12]发现超高压（450MPa、15min、15℃）处理后鳙鱼肌原纤维的肌节被彻底破坏，蛋白质分子间交联，形成了坚实的凝胶网络，硬度、弹性和咀嚼性显著上升，而当压力＜150MPa时并没有显著提高肌肉的硬度。同一阶段，145MPa、-14℃冷冻后的大黄鱼肌肉的硬度、弹性及咀嚼性与新鲜样品最为接近。

3 讨论

本文采用三种不同方法冷冻养殖大黄鱼，然后研究了鱼体肌肉在冻藏期间理化特性的变化。结果表明：PSF冻结过程中产生了大量细小的冰晶，它们均布于冻品组织中，相比之下，205MPa、-18℃条件下冻结产生的冰晶更加细小。另外在冻藏期间PSF冻结样品的肌肉显微结构及盐溶性蛋白含量均无显著变化（p＞0.05），而CAF冻结样品在冻藏期间改变显著（p＜0.05），冻藏结束以后，盐溶性蛋白含量从98.65mg/g下降到74.06mg/g，下降幅度为24.93%。与CAF相比，PSF法冷冻的样品肌肉弹性和咀嚼性均显著提高（p＜0.05）。同一阶段，145MPa、-14℃冷冻后的大黄鱼肌肉的硬度、弹性及咀嚼性与新鲜样品最为接近。

另外，由于超高压作用能杀灭食品中的多种微生物，延长生鲜食品的保质期。同时超高压处理是一个物理过程，对维生素、色素和风味物质等低分子化合物的共价键无明显影响，能够保持原有的新鲜味道和营养成分。然而，压力达到200MPa后容易引起蛋白质的不可逆变性，导致肉组织的外观发生变化，这在一定程度上削减了超高压在食品冷冻冷藏中的优势。比较而言，145MPa、-14℃条件下冻结更有利于提高养殖大黄鱼冻品品质。

[1] PP Fernandez，L Otero，B Guignon，et al. High-pressure shift freezing verse high-pressure assisted freezing：Effect on the microstructure of a food model[J]. Food Hydrocolloids，2006，20：510-522.

[2] Kanda Y，Aoki M，Kosugi T. Freezing of tofu（soybean curd）by pressure-shift freezing and its structure[J]. Journal of Japanese Society of Food Science and Technology，1992，39（7）：608-614.

[3] MN Martino，L Otero，D Sanz P，et al. Size and location of ice crystals in pork frozen by high-pressure-assisted freezing as compared to classical methods[J]. Meat Science，1998，50（3）：303-313.

[4] D Chevalier，AL Bail，M Ghou.Freezing and ice crystals formed in a cylindrical food model part II：Comparison between freezing at atmospheric pressure and pressure-shift freezing[J]. Journal of Food Engineering，2000，46：287-293.

[5] 陈淑花，赵启成，刘学武. 超高压与低温协同作用处理土豆实验研究[J]. 制冷学报，2009，30（5）：27-31.

[6] 刘世新. 实用生物组织学技术[M]. 北京：科学出版社，2004.

[7] 万建荣，洪玉菁，奚印慈，等. 水产食品化学分析手册[M].上海：上海科学技术出版社，1993.

[8] MJ Burke，MF George，RG Bryant. Water relations of foods[M]. London：Academic Press，1975：111-135.

[9] V Tironia，M Lamballerie，AL Bail. Quality changes during the frozen storage of sea bass（Dicentrarchus labrax）muscle after pressure shift freezing and pressure assisted thawing[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2010，11，565-573.

[10] 陈磊，王金勇，李学伟. 仪器测定的猪肉质构性状与感官性状的回归分析[J]. 农业工程学报，2010，26（6）：357-362.

[11] IN Ashie，BK Simpson. Effects of pressurization and refrigeratd storage on microstructure of fish muscle tissue[J].Journal of Muscle Foods，1998，9（2）：193-199.

[12] 雒莎莎，童彦，Muhammad Muzammil Jahangir，等. 超高压处理对鳙鱼质构特性的影响[J]. 中国食品学报，2012，12（5）：182-186.