重组藻红蓝蛋白α亚基的稳定性研究

王 娟，苏海璐，陈秀丽，苏 平，涂俊铭

（湖北师范学院生命科学学院，湖北黄石435002）

藻胆蛋白（包括藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白）是某些藻类重要的捕光蛋白，用途极为广泛[1]。由于其具有无毒性、水溶性、高荧光、稳定等优点既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可以制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中[2]。藻胆蛋白目前还是从藻类直接提取，生产成本很高，因此限制了其广泛的应用[3]。我们希望通过分子生物学的方法，将相关的基因重组转入大肠杆菌中，以实现藻胆蛋白的生物合成。研究表明[4-5]，通过体外表达层理鞭枝藻（Mastigocladus laminosus）中藻红蓝蛋白操纵子中E与F基因编码的产物PecE、PecF和藻红蓝蛋白（PEC）α亚基的脱辅基蛋白，在一定的重组体系里获得了具有可逆光致变色特性的α-PEC。本工作就是利用该项技术成果，获得目的蛋白。迄今为止，对于藻红蓝蛋白生物合成理论研究已相当成熟，但对于它的稳定性影响和应用研究很少有报道，而藻蓝蛋白方面已有人从事该项工作[6-9]。藻红蓝蛋白很重要的一个应用就是利用其鲜艳的红色荧光性质充当食品和化妆品天然色素，而且因为其来自于海洋藻类植物，安全性高，且具有生理活性，兼有营养、保健等功能[10]，所以更易被消费者接受。一般对食品天然色素稳定性的检验主要考虑pH、光照、温度、金属离子、抗氧化剂、碳水化合物等因素的影响[11-14]。本文主要从上述六个方面进行了藻红蓝蛋白稳定性的相关研究，为其在未来应用上奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

产藻红蓝蛋白α亚基的工程菌（含有pecE/pecF、pecA、PCB合成酶的三质粒大肠杆菌菌株） 实验室保存；蛋白胨，酵母粉，IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），Amp（氨苄青霉素），Kan（卡那霉素），Chl（氯霉素）。

4300 pro 型紫外可见光谱仪 美国Amsean Ultrospec；F-4500型荧光光谱仪 日本日立公司；飞鸽系列TGL-18G-C型台式离心机 上海安亭公司；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新芝科仪研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 藻红蓝蛋白α亚基的制备和提纯[15]挑取目的单菌落接种于5mL（氯霉素17μg/mL、氨苄霉素25μg/mL、卡那霉素15μg/mL）的LB培养基中37℃振荡培养过夜。取1mL饱和培养物转接于100mL含有对应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至对数中期（OD600约0.6），将培养物静置于20℃冰水浴中1h。然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，20℃诱导表达9～12h。离心收集菌体-20℃保存备用。将冻存的细胞重悬于柱平衡液（0.5mol/L NaCl，20mmol/L KPB，pH 7.2）中，超声10min后，离心5000r/min 5min后，分别得到上清液和沉淀。上清液直接用已预平衡的镍螯合亲合层析柱进行纯化。上样后，先用3倍柱床体积的柱平衡液和3倍柱床体积含有50mmol/L咪唑的柱平衡液洗柱，去除非特异性结合的蛋白质或杂质，再用合适体积洗脱液（500mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/L KPB，pH7.2）进行洗脱收集样品。收集液中的蛋白质浓度通过Bradford法测定。将收集液于4℃的透析液（0.5mol/L NaCl，50mmol/L KPB，pH7.2）透析后，置于4℃避光保存，继续后续实验。

1.2.2 Bradford法测定蛋白质的浓度

1.2.2.1 制作标准曲线 在1.5mL离心管中，加入标准品溶液0～10μL，加入950μL Bradford工作液并混合均匀，补加平衡液使终体积为1mL，室温放置5min后测A595nm吸收值，测三次，计算每个样品的平均吸光度值，绘制标准曲线，确定曲线的线性范围。

1.2.2.2 测定藻红蓝蛋白的浓度 在同样的条件下，测定样品的平均吸光度值，根据标准曲线，计算样品中蛋白质的浓度，并以该蛋白溶液为储存原液。

1.2.3 温度对藻红蓝蛋白稳定性影响 避光条件下，将提纯好的蛋白分别置于0、4、20、37、55、72、98℃等水浴中，隔一定时间分别测定其荧光强度。

1.2.4 pH对藻红蓝蛋白稳定性影响 配制pH为2.0、4.0、5.0、6.0、7.2、8.0、9.0、10.0、11.0、13.0等缓冲溶液，分别加入同等浓度的蛋白，测定其荧光强度。

1.2.5 紫外照射对藻红蓝蛋白稳定性影响 将5%、10%蛋白原液置于紫外线照射，每隔20min测一次荧光和紫外，观察其变化。

1.2.6 盐浓度对藻红蓝蛋白稳定性影响 取10%蛋白原液1mL加入等体积的5mol/L NaCl溶液，并测定紫外图谱。

1.2.7 碳水化合物对藻红蓝蛋白稳定性影响 分别配制1%蔗糖、葡萄糖、乳糖、0.1%淀粉的水溶液，按照1∶1比例加入到10%蛋白原液里，测定荧光图谱。

1.2.8 金属离子对藻红蓝蛋白稳定的影响 配制较高浓度Ca2+、Fe2+、Mn2+、Al3+、Cu2+、Pb2+、Zn2+等离子溶液，按照表1离子浓度加到蛋白原液里。测定其荧光强度的改变。

1.2.9 小分子对藻红蓝蛋白稳定的影响 配制较高浓度的抗坏血酸（VC）、尿素、巯基乙醇等溶液，按照1∶1比例加入到10%蛋白原液里。测定其荧光强度的改变。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质浓度的测定

根据Bradford 法，获得的色素蛋白浓度是0.43mg/mL，下面的实验根据需要进行稀释不同的倍数。

2.2 温度对蛋白稳定性的影响

避光条件下，将色素蛋白溶液分别置于以下设定温度的水浴中，间隔一定时间测定蛋白荧光。发现0、4、20℃时蛋白的荧光强度几乎没有多少改变，说明该蛋白在低温条件下很稳定。在72、98℃下，水浴5min，大量蛋白发生聚集，发现其荧光强度已经大大下降，可见高温对蛋白有剧烈的破坏作用。避光条件下12.5h过后，4、20、37、55℃下色素蛋白荧光强度依次递减。如图1所示，色素蛋白荧光随着时间的延长，均是下降趋势；温度越高，色素蛋白受到的影响越大。

图1 温度对色素蛋白稳定性影响Fig.1 Effect of different temperature on the stability of protein

2.3 pH对蛋白稳定性的影响

将色素蛋白原液稀释10倍，分别测pH 2～13溶液下色素蛋白的最高强度荧光，得到图2。从图2可以看出，蛋白在pH为7.2环境下荧光强度是最高的，在pH4.0～9.0范围内，荧光改变不大，而在pH小于3或大于10的情况下，荧光大大下降，只有初始的15%左右，稳定性被破坏。说明了该色素蛋白在过酸或过碱的情况下不能稳定存在，这与蛋白在中性条件下最稳定存在符合，因此选用的平衡液都是pH=7.2的缓冲液。

图2 缓冲液pH对色素蛋白稳定性影响Fig.2 Effect of different pH on the stability of protein

2.4 紫外照射对蛋白稳定性的影响

选用5%、10%两种浓度的蛋白，经过紫外线长时间照射，发现荧光强度不仅明显改变，荧光发射图谱也发生很大的变化。图3是紫外照射下间隔20min测蛋白最高荧光强度，随着照射时间增加，蛋白荧光强度逐渐变小；图4是蛋白经过100min照射后的荧光扫描谱图，可以看到已经没有明显的发射峰了。说明紫外线照射对蛋白稳定性影响很大，已使蛋白变性，可能是紫外照射使蛋白分子上的电子发生跃迁所致。这提示我们蛋白不宜放在任何有强紫外照射的地方。同时也做了光照与避光对比实验，结果表明，避光能让蛋白稳定的时间更长久。

图3 紫外照射对色素蛋白稳定性影响Fig.3 Effect of Ultra-Violet on the stability of protein

图4 蛋白经紫外照射后的荧光扫描光谱Fig.4 Fluorescence spectra of protein irradiated by ultraviolet

2.5 离子浓度对蛋白稳定性的影响

这里离子浓度仅指考察NaCl浓度。由于蛋白在溶液中较稳定存在，选用高浓度蛋白溶液，用NaCl溶液进行稀释不同倍数，在不同浓度NaCl下测紫外波长510nm的吸光度得到图5，测定不同浓度NaCl溶液下蛋白的紫外吸收扫描图谱得到图6。结果表明，蛋白溶液经过NaCl溶液的稀释，其紫外吸收峰位置和峰形并没有发生变化（图6）；吸光度发生了变化，这是因为蛋白溶液经过稀释所致，从吸光强度A呈线性变化可以看出（图5）。说明NaCl溶液即离子浓度对蛋白稳定性没有很大的影响。

图5 NaCl离子浓度对蛋白稳定性影响Fig.5 Effect of ion concentration on the stability of protein

图6 不同离子浓度下蛋白的紫外吸收光谱Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of protein on different ion concentration

2.6 糖类物质对蛋白稳定性影响

实验选取了蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉等糖类物质，加入到蛋白溶液里，间隔一定时间测蛋白最高荧光强度做图得到图7。从图7可以看出，同一浓度下，蔗糖对蛋白荧光猝灭的影响最小，荧光强度也最高，色素蛋白稳定性也较好。

图7 糖类物质对蛋白稳定性影响Fig.7 Effect of Carbohydrate on the stability of protein

2.7 金属离子对蛋白稳定性的影响

实验选用Ca2+、Fe2+、Mn2+、Al3+等高浓离子溶液，按图8钙离子浓度所示，加一定量高浓离子溶液到蛋白溶液稀释，扫描荧光图谱，并由离子浓度对最高荧光强度做直线图。以Ca2+为例（如图8显示），随着Ca2+浓度不断增加，荧光强度逐渐下降。初步认为金属离子与蛋白发生结合效应，或是金属离子使蛋白变性，改变了蛋白空间结构，因而影响其发射荧光的强度。

图8 Ca2+浓度对蛋白稳定性影响Fig.8 Effect of Ca2+concertration on the stability of protein

表1 金属离子对色素蛋白的影响Table 1 Effect of different metal ion on the stability of protein

同样的方法，测定了其他金属离子对蛋白的荧光影响，当离子浓度达到一定时荧光下降百分比得到表1数据。根据表1所示，对蛋白影响最大的是Cu2+，当离子浓度仅为4mmol/L时，荧光下降了89.2%，影响最小的是Ca2+，当离子浓度达到了0.67mol/L时，荧光下降了30.6%。实验还考察了Na+、K+、NH4+等，发现对其影响很小，故不在表中列出来。

2.8 小分子对蛋白稳定性影响

分别考察了尿素（NH2NH2）、抗坏血酸（VC）、巯基乙醇（ME）对蛋白紫外吸收图谱的影响。从图9可以看到，经过24h后这些小分子不同程度上使蛋白的紫外吸收图谱发生改变，程度最为剧烈的是巯基乙醇，其次是尿素和抗坏血酸。巯基乙醇的作用使蛋白发生了严重的蓝移现象，而尿素则使两个吸收峰的强度发生改变，抗坏血酸有弱小的影响。巯基乙醇可以打开蛋白质的二硫键，对蛋白原来空间结构发生一定的改变，造成了紫外吸收图谱蓝移现象。而尿素能破坏蛋白中的氢键，一定程度上影响了色素的吸收，所以有吸收比例的改变。抗坏血酸对蛋白稳定的影响较小，此外柠檬酸钠、苯甲酸钠等也几乎没有变化，可以进一步加以应用。而较强氧化性的H2O2分子则使蛋白明显变性，说明该蛋白有较弱的还原性，置于空气中很容易被氧化。

图9 小分子对蛋白稳定性影响Fig.9 Effect of different small molecules on the stability of protein

3 结论

本文利用生物技术方法表达出了具有红色荧光的藻红蓝蛋白a亚基，探讨了温度、pH、离子浓度、光照等因素影响，也考察了常见金属离子、小分子对蛋白稳定性的影响。其中温度对蛋白影响最大，超过55℃蛋白易变性；其次紫外光照也有很大影响；pH小于3或大于11蛋白不稳定，离子浓度影响不大。而大多数重金属离子都会使蛋白发生聚集下沉，荧光猝灭；钾钠离子没有影响；尿素、巯基乙醇、H2O2分子都影响色素蛋白存在，而抗坏血酸、柠檬酸钠、苯甲酸钠影响不大，可以当作添加剂。这些都为该色素蛋白今后实际应用打下必要的实验基础。

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