核因子－κB在急性百草枯中毒大鼠肾脏中的表达及其意义

陕西省人民医院西院二病区（西安710068） 时 晔 樊英华 尚 亮 刘延梅 苗 青 高 路

百草枯（Paraquat，PQ）是一种常用的广谱除草剂，在世界范围内广泛使用［1］，对人和动物有较强的毒性，其发病机制未完全阐明，也无特效解毒药物，临床治疗效果差，病死率高达60%～80%，严重危害着人们的生命健康［2］。

近年研究发现PQ进入机体后，不仅通过自由基的脂质过氧化机制引起组织损伤，还引起炎症介质和炎性因子的释放，进－步加重组织损伤。核因子－κB（Nuclear factor kappa B，NF－κB）是调节多种细胞因子和炎性介质表达最关键的转录因子，可介导肿瘤坏死因子－α（TNF－α）等炎性因子生成。有研究发现 NF－κB在全身炎症反应综合征（SIRS）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及多脏器功能衰竭等疾病病理生理方面的重要作用，适当抑制NF－κB的活化，能够下调炎性介质的产生，改善上述疾病过程中引起的机体损伤和器官功能衰竭［3］。NF－κB是否调控炎性因子参与急性PQ中毒肾组织损害，国内目前少见报道。

材料与方法

1 动物分组及模型制备 选择6周龄健康清洁SD大鼠60只，雄雌各半，体重150～200g（172±15g），购于第四军医大学实验动物中心。随机分三组，每组20只。

对照组（A组）：1ml生理盐水腹腔内注射；低剂量染毒组（B组）：按15mg／kg将PQ稀释后腹腔内注射；高剂量染毒组（C组）：按30mg／kg将PQ稀释后腹腔内注射。染毒后12h、24h、72h、120h，各组随机取5只大鼠处死，右肾制备10%的组织匀浆，左肾10%中性甲醛固定行病理观察及免疫组化染色。

2 主要试剂 20%PQ溶液（英国先正达公司），TNF－α检测试剂盒（深圳晶美生物工程公司），EnVision免疫组化检测试剂盒（基因科技上海公司），兔抗鼠NF－κB P50多克隆抗体（美国Santacruz公司 货号sc－114）。

3 TNF－α测定及HE染色 双抗体夹心酶联吸附法测定匀浆中的TNF－α浓度，HE染色病理观察（切片厚5μm）。

4 肾组织NF－κB的免疫组化分析 肾组织切片烤片脱蜡后，浸入柠檬酸缓冲液高压抗原修复（121℃5min），自然冷却至室温。滴加稀释的一抗（Antibody Diluent稀释），4℃过夜。滴加生物素标记二抗（Chem Mate En TMVision＋／HRP）工作液，室温30min，以PBS代一抗作阴性对照，DAB显色，肉眼看到棕色立即终止染色，透明及封片，电镜下观察阳性细胞。每只大鼠制片5张，光镜下随机选取4个完整且不重叠高倍视野（×400），以胞浆或胞核出现棕黄色着色颗粒为阳性标记。判断结果采用免疫组织化（Immunohistochemistry score，IHS）标准，分别按阳性细胞百分数及阳性细胞染色强度计分［4］：A为阳性细胞数比例分级0（0～1%）、1（1%～10%）、2（10%～50%）、3（50%～80%）、4（80%～100%），B为阳性细胞显色强度分级0（阴性）、1（浅黄色为弱阳性）、2（浅棕黄色为阳性）、3（棕黄色为强阳性）；IHS＝A×B。

结 果

1 大鼠染毒后表现：A组大鼠活动灵敏，尿量正常；B组大鼠8～20h出现食欲减退，呼吸急促等；C组大鼠1～3h出现倦怠、嗜睡、烦躁、走路不稳、头颤，食水量明显减少，呼吸急促，血尿、少尿或无尿，还有松毛、易捕捉等症状。

2 肾功能检测结果：PQ染毒后大鼠出现肾功能损害，且随染毒剂量和时间呈正相关，见表1。

3 肾组织匀浆TNF－α动态变化及其意义：大鼠肾组织TNF－α染毒后12h开始逐渐升高，至观察终点仍处于较高水平，C组明显高于B组，提示急性PQ中毒早期肾脏炎性损伤过程中，TNF－α可能起重要作用，见表2。

4 肾脏组织病理学观察：A组肾小球及肾小管结构清晰，无炎性细胞浸润，小管内无管型及颗粒（图1）；B组肾小静脉及间质毛细血管淤血，小管上皮细胞肿胀及管腔变窄，72h可见水肿渗出、坏死，间质可见炎性细胞浸润（图2）；C组早期可见小血管扩张淤血，小管上皮肿胀重，包膜张力增大及出血点、淤血，皮髓质界限模糊，可见大量炎性细胞浸润及部分细胞破坏，管腔内有蛋白管型 （图3）。

5 肾组织NF－κB的表达，见表3。

表1 三组不同时间点血清Cr、BUN水平（±s）

表1 三组不同时间点血清Cr、BUN水平（±s）

注：与A组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

组 别 12h 24h 72h 120h A组 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）37．0±1．66 8．7±1．26 36．2±2．67 8．5±1．67 36．4±2．23 8．7±1．23 35．5±1．32 8．5±1．32 B组 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）63．5±4．70＊13．5±2．30＊C组 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）38．1±2．23 10．8±1．23 39．2±1．21 12．2±1．21＊54．1±3．45＊14．1±2．45＊43．4±2．59＊15．5±2．57＊88．6±6．10＊＊19．6±3．1＊108．4±2．43＊＊25．4±2．43＊＊112．0±5．92＊＊24．0±3．92＊＊

表2 三组不同时间点肾组织TNF－α水平（μg／L，±s）

表2 三组不同时间点肾组织TNF－α水平（μg／L，±s）

注：与 A组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；与B组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01

组 别 12h 24h 72h 120h A组 7．34±0．25 6．85±0．64 7．33±0．52 7．40±0．45 B组 10．33±0．48 12．45±0．62＊ 28．46±1．53＊＊ 25．36±1．28＊＊C组 12．40±3．62＊ 22．41±3．78＊＊△ 39．65±4．02＊＊＊△△ 36．65±3．27＊＊＊△△

表3 三组不同时间点肾组织NF－κB的IHS评分（±s）

表3 三组不同时间点肾组织NF－κB的IHS评分（±s）

注：与 A组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；与B组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01

组 别 12h 24h 72h 120h A组 0．12±0．03 0．05±0．01 0．06±0．02 0．05±0．01 B组 0．47±0．05 1．65±0．12＊ 1．98±0．18＊＊ 2．1±0．25＊＊C组 1．87±0．14＊△ 5．62±0．78＊＊＊△△ 6．96±0．54＊＊＊△△ 8．20±0．82＊＊＊△△

A组NF－κB不表达或很少表达，仅见极少数肾小管细胞浆棕黄色淡染，各时间点间无差异（图4）；B组NF－κB表达在12h与A组大鼠无明显差异，而在24h、72h、120h表达增多，并随时间延长呈线性升高趋势，至观察结束仍保持较高水平，有显著统计学差异（图5）；C组NF－κB表达在12h即升高，以后各时间点随时间延长呈线性升高趋势，72h左右达到高峰且见核表达。C组NF－κB表达在12h较A组及B组均有显著性差异；在24h、72h、120h较A组有非常显著的统计学差异，较B组有显著的统计学差异（图6）。

结果提示：急性PQ中毒后肾组织NF－κB表达较早且非常强烈，尤其在C组，结合临床重度中毒者早期发生肾功能损害比例高，可能有较重要的意义。

讨 论

PQ造成机体损伤是多系统、多器官、多水平的，体内的PQ主要以原形从肾脏排出，24h内可排出50%～70%。一项关于PQ中毒荟萃分析［5］，检索了1994年至2006年国内期刊数据库公开发表的论文及Medline相关报道1069例患者，肾损伤的发生率高达64．9%，其中死亡466例占到肾损伤的67．1%，可以看出肾损伤是影响预后的重要因素。目前认为氧化应激、炎性损伤、基因异常、细胞凋亡、钙超载等诸多因素参与肾损害的发生与发展。

NF－κB作为一种多效转录因子，在调节多种细胞因子和炎性介质表达中发挥着关键作用，逐渐证实它激活后在感染、中毒等疾病致多脏器功能损害中的重要角色。佟飞等［6］建立大鼠急性肺损伤模型后，采用电泳迁移率法检测大鼠肺组织NF－κB活性，发现染毒组NF－κB活性明显高于对照组和治疗组，提示急性肺损伤时NF－κB活性增强。TNF－α参与机体炎症反应和免疫过程，是介导机体炎症反应的关键因子，可以通过NF－κB诱导表达，也可以通过自分泌和旁分泌调节自身及其它因子的表达，对肾脏产生潜在的损害作用。NF－κB主要由P50和P65两个亚基组成，通常与抑制蛋白IκB形成三聚体，以失活状态存在于细胞质中。氧化应激时，机体活性氧大量增加引起IκB－NF－κB复合体降解，NF－κB活化，在基因水平启动包括TNF－α、IL－8等炎症因子和炎性介质的表达，参与炎症、组织器官纤维化、细胞再生和凋亡等病理生理过程。已有研究提示急性PQ中毒后NF－κB被激活上调TNF－α的转录，使TNF－α等炎性因子生成增多，研究同时发现TNF作为细胞因子家族中最强效的炎症介质，在结合TNF－R以后，可刺激 NF－κB与IKB解离。此时，TNF－α－NF－κB 形成了一个正反馈 信号，促使TNF－α大量表达，这种恶性循环在及 MODS的发生发展中有重要意义。

本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠动物模型，染毒后数小时出现不同程度的血尿、少尿或无尿及神经精神症状，血肌酐、尿素氮升高，HE染色见肾小球体积增大，近曲小管上皮细胞肿胀、变性、空泡样变、坏死，肾小管管腔变窄甚至闭锁，间质充血、水肿、炎性细胞浸润，提示PQ中毒早期可致肾损伤，尤其在重度中毒组。

实验发现肾组织TNF－α浓度在B组24h、C组12h时开始升高，以后的时间点呈逐渐增加趋势，尤其在NF－κB表达后显著升高，在时间上与肾组织病理损害程度相关，故认为TNF－α介导的炎症反应参与急性肾损伤的发生与发展过程。本研究显示PQ中毒后12h即出现肾脏组织NF－κB的表达升高，且持续较长时间，提示NF－κB可能参与了肾脏炎性损害及功能衰竭的发生。中毒后24h大鼠肾组织TNF－α水平开始升高，至72h达峰值，各时间点结果与对照组比较均有显著性差异，且肾组织TNF－α明显升高出现在NF－κB高表达之后，提示NF－κB被激活后上调TNF－α的转录，使TNF－α生成增多。NF－κB活化抑制炎症细胞凋亡，导致炎症细胞数量异常增加，炎症细胞过度激活后释出大量细胞因子和炎症介质，造成组织损伤。而组织损伤、大量的促炎细胞因子和炎症介质反过来又促进NF－κB的活化，形成复杂的网络，使机体出现器官损伤或功能障碍。通过以上实验推测，NF－κB参与的炎症反应，也是PQ中毒者多脏器功能障碍或死亡的－个重要因素。

已有研究表明，NF－κB在炎性介质的激活和SIRS的发生、发展中发挥了重要作用，本研究发现在PQ中毒后肾组织NF－κB高表达，提示NF－κB可能参与了PQ中毒早期肾脏损害，如果在疾病早期适度地抑制NF－κB的激活，进而下调炎性介质的产生，将会为治疗急性PQ中毒早期引起的肾脏损伤和器官衰竭提供－种新的治疗办法。

［1］ 陈世铭，高连永．急性中毒的诊断与救治［M］．北京：人民军医出版社，1996：179－182．

［2］ Hwang KY，Lee EY，Hong SY，et al．Paraquat in toxieation in Korea［J］．Archives of Environmental Health，2002，57（2）：162－166．

［3］ 耿东升．NF－κB及其致炎作用和化学抑制剂［J］．解放军药学学报，2009，25（3）：250－25．

［4］ Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al．Cox－2is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］．Cancer，2000，89（3）：2637－2645．

［5］ 刘芙蓉，石汉文，扈 琳，等．肾损伤对百草枯中毒患者预后影响的分析［J］．临床荟萃，2008，23（2）：119－121．

［6］ 佟 飞，田英平，霍书花，等．P38MAPK及核因子－κB在百草枯致大鼠肺损伤中的变化［J］．中华劳动卫生职业病杂志，2007，25（9）：518－522．