光动力疗法抑制兔耳增生性瘢痕形成的实验研究＊

西安交通大学医学院第二附属医院皮肤科 （西安710004） 王 琼 袁景奕 王秀莹 董颖颖 张鼎伟

增生性瘢痕（HS）是一种顽固的皮肤病，目前常用的各种治疗方法并不理想，还会产生不同程度的不良反应［1，2］。光动力疗法（PDT）广泛应用于各种肿瘤性疾病和皮肤病，并且不会产生显著的不良反应［3］。基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）对细胞、血管、组织具有复杂的调节作用。因此我们提出PDT的作用机理与调节 MMPs／TIMPs的平衡有关，拟使用不同浓度的5－氨基酮戊酸（ALA）－PDT对兔耳HS模型进行干预，观察其对皮损外观、组织病理的影响。同时检测标本中 MMP－2、3、9及TIMP－1蛋白的表达和β－半乳糖苷酶（β－gal）浓度，初步探讨PDT对的HS的治疗作用机制。

材料与方法

1 材料与试剂

1．1 主要仪器试剂：XD－635AB型光动力激光治疗仪和ALA购自中国上海复旦张江生物医药股份有限公司。RNA抽提试剂盒Rneasy kit购自德国Qiagen公司。荧光定量RT－PCR分析仪、SYBR green与Taq－DNA聚合酶混合试剂LightCycler均购自瑞士Roche公司。β－gal酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自美国santa cruz公司。

1．2 实验动物：选择新西兰大耳白兔10只，雌雄不限，质量2．0－2．5kg，饲养环境22±2℃，12h昼夜循环。参照Kloeters等的方法建立兔耳HS模型［4］。

2 实验方法

2．1 实验分组：将形成的HS随机分为5组，造模后第3周进行ALA－PDT干预：①20%ALA组局部使用ALA溶液浓度236mg／ml；②10%ALA组使用溶液浓度118mg／ml；③直接照射组（Dr）不使用ALA溶液；④无任何处理的阴性对照组（Neg）；⑤选取阴性对照组兔耳正常皮肤组织作为正常对照组（Nor）。具体方法：用配好的ALA药液浸湿医用药棉，覆盖于创面，封包3h后进行激光照射，设置为光斑1．0cm，时间20min，能量密度114．6J／cm2。于瘢痕形成后每周处理1次，总共4次。于治疗结束后60d观察各组瘢痕形态。

2．2 Masson胶原染色：根据Masson’s三色染色试剂盒操作说明，组织切片用二甲苯去石蜡，梯度乙醇水化，在Weigert＇s苏木紫工作液中染色10min，品红溶液染色5min，置于1% 磷酸盐溶液中浸5min后将切片移至甲苯胺蓝溶液染色5min，漂洗、脱水、清洁、包埋，胶原纤维被染成蓝色。

2．3 RT－PCR 测 MMP／TIMP mRNA：使 用Rneasy kit试剂盒进行组织总RNA的抽提，用Taq－Man逆转录试剂进行RT－PCR，利用荧光定量RTPCR分析仪LightCycler和SYBR green与Taq－DNA聚合酶混合试剂对 MMP－2、3、9、TIMP－1和 GAPDH的mRNA起始量进行分析比对，从溶解曲线可以确定Ct值和样本中最初的mRNA拷贝数。结果数据以所检测的mRNA拷贝数／GAPDH mRNA拷贝数的相对值表示。

2．4 ELISA法测β－gal浓度：皮肤组织匀浆离心取上清，按ELISA试剂盒说明书操作，用450nm酶标仪检测并生成标准曲线，根据标准曲线得出最终结果。

3 统计学方法 应用SPSS 13．0统计软件包作数据处理，所有数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用ANOVA方差分析。

结 果

1 外观形态变化：兔耳创面上皮化后局部形成高出于周围正常组织的瘢痕，共造80个创面，术后3周最终形成78处HS模型，选取其中72处作为实验观察对象。在PDT治疗4次后，瘢痕组织开始出现软化、变平，增生块颜色逐渐变淡。治疗后60d，瘢痕明显软化，颜色和质地均接近正常皮肤。20%ALA组较10%ALA组为好，10%ALA组较Dr组为好。

2 Masson胶原染色：阴性对照组兔耳HS（图1 E）与正常皮肤组织（图1A）比较可见大量蓝染较深的胶原纤维，增厚密集，外形粗大，排列杂乱无章。治疗后60d的HS虽然也可见蓝染的胶原纤维，但较治疗前蓝染变浅且纤细，胶原纤维数量减少，排列疏散并趋于一致，并且改善程度20%ALA组（图1B）＞10%ALA组（图1C）＞Dr组（图1D）。20%ALA组的组织病理形态已接近正常对照。

图1 各组胶原纤维 Masson染色（光镜×400）A：正常对照组，B：20%ALA组，C：10%ALA组，D：Dr组，E：阴性对照组

图2 荧光定量RT－PCR检测 MMP／TIMP mRNA结果（与阴性对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

图3 ELISA法检测β－gal浓度结果（与阴性对照组比较＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

3 RT－PCR测 MMP／TIMP mRNA：RT－PCR结果显示 MMP－2、3、9和 TIMP－1在正常皮肤组织中的mRNA表达量均较少。阴性对照组MMPs mRNA表达受抑制，低于正常，经PDT治疗后升高，20%ALA组＞10%ALA组＞Dr组。阴性对照组TIMP－1mRNA呈强表达，经治疗后降低，20%ALA组＜10%ALA组＜Dr组。GAPDH mRNA在各组的表达无显著差异（图2）。

4 ELISA法测β－gal浓度：所有PDT治疗组的βgal浓度水平显著高于阴性对照组，其中20%ALA组＞10%ALA组＞Dr组，并且20%ALA组水平接近于正常对照组（图3）。表明PDT可促进成纤维细胞的老化。

讨 论

机体内的细胞衰老是一种重要的抗肿瘤防卫机制，创伤修复过程中老化型成纤维细胞在控制其增殖和胶原合成方面起着重要的作用，是瘢痕形成的重要抑制因素［5］。我们以往在培养成纤维细胞过程中也发现复制老化的成纤维细胞I、Ⅲ型胶原合成量减少［6］。病理性瘢痕现有的手术切除、放疗等治疗方法无法诱导病变部位发生足够量的细胞老化，同时还会引起细胞凋亡或坏死，死亡的细胞又会诱发新一轮的增殖修复，造成了临床疗效差且复发率高。因此，如果使成纤维细胞提前进入衰老阶段，控制其细胞增殖及胶原合成，将有可能从根本上改变各种病理性瘢痕的发展。

研究发现MMPs／TIMPs在HS组织及光老化皮肤中的表达明显异于正常皮肤，MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的联合作用可以降解大部分真皮ECM［7～9］，而 TIMP1 主 要 抑 制 MMP1、MMP3 和MMP9［10］。我们的研究中，阴性对照组兔耳 MMPs表达最低，TIMP1表达最高，表明在兔耳的HS组织中细胞老化受到抑制，给予PDT后的各组兔耳MMPs表达明显升高、活性增强，同时TIMP1表达和活性降低，表示应用PDT可诱导瘢痕形成过程中的MMPs／TIMPs比例发生变化，促进成纤维细胞老化，从而显著降低胶原蛋白和ECM的合成、抑制HS形成。

本实验中对兔耳HS模型形成的早期（术后第3周）即开始进行PDT治疗，使用较高浓度ALA治疗4次后效果非常满意，目前很多应用PDT治疗瘢痕的研究也表明对此类患者早期治疗的疗效更佳［11］。另外，由于PDT的无创性，并且对新愈合的创面也无明显刺激和毒副作用，因此我们建议对HS患者在发病早期进行PDT治疗，并且适当增加光敏剂的浓度以达到更好的疗效。另外PDT治疗各种病理性瘢痕还具有以下优势：①PDT组织选择性好、作用于光敏药物局部、毒性低、创伤小，可最大程度的保护容貌及重要器官功能。②病理性瘢痕形成过程中增殖旺盛的成纤维细胞功能活跃，这些细胞较普通细胞可以摄取并储蓄更多的光敏剂。本研究为PDT治疗病理性瘢痕提供了理论支持和依据，并对病理性瘢痕的治疗提供新的思路。

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