芹菜籽提取物诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的实验研究

张 伟 李福荣

(泰山医学院，山东 泰安 271000)

芹菜籽含有丰富的营养元素以及多种具生理活性的物质，主要包括挥发油化合物、不饱和脂肪酸、类黄酮物质、丁基苯酞类、氨基酸、膳食纤维、香豆素衍生物等多种物质。芹菜籽具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性，它的提取物对已孕或未孕子宫具有收缩作用，可以治疗痛经［1］，在澳洲，芹菜籽油还被用于治疗关节疼痛。芹菜籽作为一种具有良好发展前景的抗肿瘤药物，已受到研究者的广泛关注，但对卵巢癌细胞的影响及分子机制尚未见报道。本课题就芹菜籽提取物对卵巢癌细胞的凋亡作用进行了实验研究，旨在为芹菜素应用于卵巢癌的临床治疗提供实验资料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌细胞SKOV-3购于中科院上海细胞所，培养瓶，培养板(costar公司)，RPMI-1640细胞培养液(Gibic公司)，10%新生牛血清(杭州四季青公司)，ECL化学发光试剂盒(美国promega公司)，硝酸纤维素膜(英国Buckinghamshire，Amersham公司)

1.2 方法

1.2.1 CO2超临界萃取法(SFE--CO2)提取芹菜籽粗提物取经烘干、粉碎、过筛(60目)的芹菜籽350 g，SFE流程:CO2钢瓶→冷冻系统→高压泵→萃取釜→解析釜Ⅰ→解析釜Ⅱ→冷冻系统(循环)。萃取物为半固体油状物，颜色为深褐色，得到量为98 g。

1.2.2 对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)消除率的测定用70%乙醇配制浓度分别为不同浓度的芹菜籽提取液混合物溶液2.5 ml。配制0.2 mmol/L的DPPH溶液。取500 μL样液加入2 ml 0.2mmol/L的DPPH溶液和1.5 ml 70%乙醇，摇匀后水浴30 min，以70%乙醇溶液作对照，分别测定517 nm处的吸光值A。同时测定样本溶液500 μL与3.5mL70%乙醇溶液混合后517nm处的吸光值A0，再测定2 ml DPPH溶液与2 ml 70%乙醇混合液在517nm处的吸光值A1，所有测定平行进行三次，取平均值。

按下式计算其清除率［2］:

清除率(%)=［1-(A-A0)/A1］×100

1.2.3 细胞培养 将卵巢癌SKOV-3细胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、体积分数0.05%CO2饱和湿度的培养箱中无菌培养，待细胞汇合度达80～90% 时，以0.25%胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行以下实验。

1.2.4 激光共聚焦显微镜观察实验各组药物对凋亡的影响 制备细胞爬片，终浓度为0.05、0.5、5 μg/L的芹菜籽提取物作用12h。室温下4%多聚甲醛固定20 min。每片盖玻片加Annexin-V FITC和碘化丙啶(PI)染色封片，立即在488 nm波长下用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。

1.2.5 Western blot检测Caspase-3蛋白的表达

设空白对照组及 0.05，0.5，5 μg·/L CSE 处理组。收获处理12 h后的各组细胞，用RIPA液裂解提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取40 μg总蛋白选择12%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，完毕后将蛋白质电转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉的TBST封闭4 h后分别加1∶500稀释的兔抗人Caspase-3多克隆抗体，4℃ 孵育过夜，TBST洗涤3次，再加1∶1000稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG温育2 h，TBST洗3次，进行显影。用Image-Pro Plus-Version 6.0 for windowsTM图像处理系统分析目标条带的灰度值，以表示Caspase-3蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 DPPH消除率的测定

DPPH是一种非常稳定、可以长时间保存的自由基，经常被用来作为测试抗氧化性试剂。当它遇到能释放质子的物质或者被还原时，自由基被消除，化合物溶液颜色发生显著变化，溶液从紫色脱至淡黄色。加入样品后，在517nm处测定其吸光度的变化，可求得样品对DPPH的消除率。结果表示芹菜籽提取物具有较强的抗氧化能力，并且在一定范围内具有一定的浓度依赖性。见表1。

表1 芹菜籽提取物对DPPH的清除率

图1 激光共聚焦显微镜检测CSE对SKOV-3细胞凋亡的形态学改变

2.2 CSE对SKOV-3细胞凋亡的作用

经0.05、0.5、5 μg/L CSE 处理12 h 后，激光共聚焦显微镜观察到，在损伤组早期以及晚期凋亡细胞数均较多，早期凋亡的形态学表现为细胞膜着绿色，晚期则表现为细胞核着色，或者红色细胞核浓染固缩并将游移出细胞，即典型的凋亡小体表现。另有较多的细胞主要呈现红色的细胞核，细胞膜破碎甚至而不见细胞膜，呈现晚期凋亡典型的形态学表现。见图1。

2.3 CSE对SKOV-3细胞Caspase-3蛋白表达的影响

经0.05、0.5、5?g/L CSE 作用12h后，采用Western blot检测各组细胞中Caspase-3蛋白表达，可见各组细胞中内参蛋白β-actin条带亮度相似，在32 kD位置均出现Caspase-3特异性蛋白条带，但经过CSE处理后，Caspase-3蛋白条带表达明显增加(P＜0.05)。见图2。

图2 CSE对SKOV-3细胞Caspase-3蛋白表达的影响

3 讨论

自由基在生物体衰老与疾病以及正常的免疫、代谢与细胞信号传导等过程中都起着重要的生理作用，有机体的许多病理生理现象如衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤都与自由基对机体的氧化损伤有关，因此寻找能够清除自由基的抗氧化剂就显得十分重要，此外清除自由基作用可能也是芹菜籽具有抗肿瘤活性和提高肌体免疫能力的一个因素。

中草药中含有丰富的自由基清除成分，研究表明芹菜籽提取物还具有一定的抗氧化性，芹菜所含丰富的黄酮类化学物具有抗氧化清除自由基的能力。Momin RA［3］从芹菜籽中得到的两种化合物在浓度分别为125g/L、250g/L时显示出很好的抗氧化性。其中黄酮中含有的3-正丁基苯酞和芹菜镇静素(Sedanolide)具有抗肿瘤的活性，可使肿瘤发生率从68%各下降至30%和11%。南京赵珺的研究表明芹菜素在25～100μg/mL范围内能有效清除DPPH自由基和羟自由基(HO·)，减轻HO·对DNA 的损伤［4］。

在本实验中，我们使用紫外分光光度计测定溶液吸光度，利用DPPH实验检测芹菜籽提取物各成分抗氧化作用的能力，结果证实芹菜籽的提取物具有较强的抗氧化能力，并且与浓度呈现一定依赖性。

应用Annexin-V联合PI双染色法对卵巢癌细胞染色，激光共聚焦扫描显微镜观察，Annexin-V可以细胞膜的磷脂酰丝氨酸发生特异性结合，当细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外露，Annexin-V可以与其结合，细胞膜呈现绿色荧光，所以可以用来检测凋亡早期细胞;PI可以在凋亡后期进入凋亡小体，与DNA结合，细胞核呈现绿色荧光，所以可以用来检测晚期凋亡细胞。该染色可以区分早期和晚期凋亡的细胞。

实验结果表明，一定浓度的CSE对SKOV-3细胞作用12h就可以显著增加细胞的凋亡，且随着浓度的增加，CSE对SKOV-3细胞的促凋亡作用逐渐增强，呈一定的剂量依赖性。

目前大多数学者认为细胞凋亡受抑是肿瘤发生的重要原因，诱导肿瘤细胞凋亡已成为现代抗肿瘤治疗的新策略。细胞凋亡受机体促凋亡调节分子如Caspase家族和抑制凋亡调节分子如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisproteins，IAP)等家族的调节，是一种细胞程序性的死亡过程，是机体清除衰老、损伤和突变细胞的重要方式。目前在人体内已发现Caspase家族中起核心作用的是Caspase-3［5］。同时Caspase-3活性增加是细胞凋亡的一种重要机制。因为正常情况下细胞质中的Caspase-3以无活性的procaspase-3形式存在，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用将无活性的前体procaspase-3激活成活化的Caspase-3，从而引起细胞凋亡。

实验中我们采用 Western blot检测发现经0.05、0.5、5 μg/L CSE 作用 12h 后，检测到各组细胞中Caspase-3蛋白表达，处理后的 SKOV-3细胞中Caspase-3蛋白表达增加(P＜0.05)，随着浓度增加，Caspase-3条带亮度增加。因此我们推测芹菜籽可能通过增加Caspase-3的活性，从而诱导卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡。

［1］ 江苏新医学院.中医大辞典:上［M］.上海:上海科技出版社，1986.

［2］ 王威.黄酮类食用天然色素抗氧活性的研究［J］.食品科学，2001，22(5):262-281.

［3］ Momin R A，Nair M G.Antioxidant，cyclooxygenase and topoisomerase inhibitory compounds from Apium graveolens Linn seeds［J］.Phytomedicine，2002，9(4):312-318.

［4］ 赵珺，王丽，李磊，等.芹菜素对自由基致DNA损伤的保护作用及机制［J］.食品科学，2011，32(13).113.

［5］ Fan T J，Han L H，Cong R S，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37(11):719-27.