嘧菌环胺在葡萄和土壤中的残留规律

王冬兰， 简 秋， 柯昌杰， 宋稳成， 孙 星， 汪佳蕾， 杨邦保

(1.农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室，农业部农产品质量安全风险评估实验室(南京)，江苏 南京 210014;2.农业部农药检定所，北京 100125)

葡萄是世界“四大果树”之一，也是重要果树种类［1］。中国葡萄生产发展速度居国内果品之首［2］，截至2010年底，葡萄栽培总面积5.2×104hm2，居第6位，仅次于柑橘、苹果、梨、桃和荔枝［3］;总产量8.548 9×106t，居第6位，仅次于苹果、柑橘、梨、桃和香蕉［4］。随着国家现代农业产业技术体系的启动与实施，中国在葡萄栽培种植科研方面取得了较大进展，有力地推动了葡萄产业的健康可持续发展。由于葡萄种植具有生长周期长、病虫害种类多等特点，因此农药残留是影响葡萄质量安全与消费者健康的主要因素之一。嘧菌环胺为嘧啶胺类内吸性杀菌剂，主要是在病原真菌的侵入期和菌丝生长期施用，通过抑制蛋氨酸的生物合成和水解酶的生物活性，导致病菌死亡。嘧菌环胺可迅速被植物叶面吸收，具有较好的保护性和治疗活性，可防治谷物、蔬菜和水果等多种作物的灰霉病［5－8］。目前中国尚未制定嘧菌环胺在葡萄中的最大残留限量标准值(MRL)，国际食品法典委员会(CAC)制定其在葡萄中的MRL值为3 mg/kg。本试验拟开展嘧菌环胺在葡萄上的残留规律研究，为制定其在葡萄上的最大残留限量标准提供评价数据，指导该药在葡萄生产中的合理使用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 Agilent－1200型液相色谱仪 (配有 DAD检测器)，色谱柱为 Agilent extend－C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

1.1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯;超纯水为标准品(纯度＞95%，德国ACROS公司产品);N－丙基乙二胺键合固相吸附材料(PSA)购于DIMA Technology Inc.Richmond Hill，USA;无水硫酸镁(北京化学试剂公司产品)在500℃马弗炉中烘5 h;嘧菌环胺标准品购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度98%;50%嘧菌环胺水分散粒剂为市售。

1.1.3 标样的配制 精确称取嘧菌环胺标准品(精确至0.1 mg)，甲醇定容至50.0 ml，配成标准母液。再用空白葡萄和土壤的提取液配制成0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L系列浓度的标准工作液。配制好的标准工作液置于4℃冰箱中备用。

1.2 田间试验

按照《农药登记残留田间试验标准操作规程》［9］，于2012年分别在北京市、江苏省南京市、山东省烟台市3个试验点进行残留试验。各试验点分别设葡萄低剂量(800 mg/kg，a.i.)、葡萄高剂量(1 200 mg/kg，a.i.)两个施药剂量。每个剂量再设施药3次、4次(间隔7 d施药1次)2个施药次数。同时设葡萄残留消解动态和土壤消解动态2个试验，均为1 200 mg/kg，a.i.，各施药1次，每个处理3次重复，每小区面积20 m2，用于残留动态试验的葡萄系绳标记，同时设不施药对照小区。

最终残留试验处理中葡萄和土壤样品的采收:在最后一次施药后7 d、14 d和21 d后，随机在试验小区内不同方向及上下不同部位采集6串以上(不少于2 kg)生长正常、无病害、成熟的葡萄;同时用土壤采样器在试验小区内随机选6～12采样点，采集地表以下0～15 cm土壤。

葡萄残留消解动态试验处理中葡萄样品的采收:于施药后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d采用随机方法在试验小区内不同方向及上下不同部位采集6串以上生长正常、无病害、成熟的系绳标记过的葡萄(不少于2 kg)。

土壤残留消解动态试验处理中土壤样品的采收:于施药后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d随机选10点以上用土壤取样器取0～10 cm深土样1 kg左右。

1.3 样品制备

将采集到的葡萄样本用捣碎机捣碎，装入密封袋中，贮存于－20℃冰箱内待分析。将采集到的土壤样本混合均匀，贮存于－20℃冰箱内待分析。

1.4 残留分析方法

1.4.1 提取方法 称取捣碎的葡萄样本15.0 g或土壤样本10.0 g于离心管中，加入乙腈15 ml，涡旋振荡1 min，然后加入1.5 g NaCl和6 g MgSO4涡旋1 min，4 000 r/min离心 5 min，取上层清液 1 ml到称有150 mg无水MgSO4和50 mg PSA的2 ml离心管中，涡旋30 s，取500 μl上清液过 0.22 μm 滤膜到自动进样瓶中，待测［10－12］。

1.4.2 液相色谱检测条件 流动相:使用梯度洗脱模式，甲醇∶水=60∶40(体积比)，保持1 min，在1～15 min变换到甲醇∶水=70∶30(体积比)，保持20 min。检测器波长:270 nm;流速:1.0 ml/min;进样量:20 μl［10－12］。

2 结果

2.1 回收率与最低检出限

采用保留时间定性，外标法峰面积定量。分别在空白葡萄或土壤样品中添加不同质量分数的嘧菌环胺标样(0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、1.00 mg/kg)，按上述提取、净化和仪器分析步骤进行测定，每个添加水平重复5次。嘧菌环胺相对保留时间为12.7 min左右。添加回收试验结果表明，嘧菌环胺在葡萄中平均回收率为81.1%～92.6%，相对标准偏差为4.8% ～9.0%;在土壤中平均回收率为80.1% ～91.8%，相对标准偏差为3.0% ～9.7%(表1)。该方法对葡萄和土壤中嘧菌环胺残留的最低检出限均为0.05 mg/kg。该方法符合NY/T 788—2004《农药残留试验准则》的要求［13］。

表1 嘧菌环胺在葡萄和土壤中的添加回收率(n=5)Table 1 Recoveries of cyprodinil in grape and soil(n=5)

2.2 嘧菌环胺在葡萄和土壤中的残留动态

嘧菌环胺在北京市、江苏省南京市和山东省烟台市3个不同试验点葡萄和土壤中的残留消解动态见图1，降解动力学方程见表2。嘧菌环胺在葡萄和土壤样品中的降解计算采用一级动力学方程式(Ct=C0e－kt)［14－15］。试验结果表明，在施药当天，嘧菌环胺在各试验点葡萄中的残留量为1.16～2.43 mg/kg，在土壤中的残留量为0.85～4.21 mg/kg，随着采样时间的延长，葡萄中嘧菌环胺的含量均降低。嘧菌环胺在不同试验点葡萄中的原始沉积量差异较大(北京:2.43 mg/kg;江苏:1.16 mg/kg;山东:1.84 mg/kg)。由葡萄品种不同而引起的葡萄表面积差异能导致农药在葡萄上的残留量有明显差异，由不同试验点的葡萄种植密度不同而导致的农药用量不同也能引起农药在葡萄上残留量出现差异。同时，施药的天气条件，如温度、相对湿度、风速等也能导致嘧菌环胺在不同试验点葡萄上原始沉积量存在差异。施药后5 d，嘧菌环胺在3个试验点葡萄中的降解率均达到50%以上。施药后14 d，嘧菌环胺在葡萄中的降解率均达到了90%以上。施药后5 d，嘧菌环胺在3个试验点种植葡萄土壤中降解率也均超过了80%。从表2可以看出，嘧菌环胺在山东省烟台市试验点葡萄中的半衰期最长(4.2 d)，在江苏省南京市试验点葡萄中的半衰期最短(1.7 d)。嘧菌环胺在北京试验点土壤中的半衰期最长(4.1 d)，在江苏南京试验点土壤中的半衰期最短(3.1 d)。

表2 嘧菌环胺在葡萄和土壤中的消解动力学方程Table 2 Degradation equations of cyprodinil in grape and soil

图1 嘧菌环胺在葡萄和土壤中的残留消解动态Fig.1 Degradation dynamics of cyprodinil in grape and soil

2.3 嘧菌环胺在葡萄和土壤中的最终残留

按低剂量、高剂量分别施药3次和4次后，在距最后一次施药7 d、14 d和21 d时葡萄和土壤样品中嘧菌环胺残留量见表3和表4。嘧菌环胺在葡萄中的残留量为 0.05～3.85 mg/kg。低剂量和高剂量施药3次和4次处理，在最后一次施药后21 d，葡萄中嘧菌环胺均低于2 mg/kg(美国限量标准)。在相同施药剂量和施药次数条件下，随着采样间隔期的延长，各试验点葡萄中嘧菌环胺的残留量随之下降;在相同采收间隔期和施药次数条件下，各试验点高剂量处理葡萄中嘧菌环胺的残留量均高于低剂量处理;在相同采收间隔期和施药剂量条件下，各试验点葡萄中嘧菌环胺的残留量随着用药次数的增加而增加。种植葡萄地的土壤中嘧菌环胺的含量为0.11 ～3.21 mg/kg。

表3 嘧菌环胺在葡萄中的最终残留量Table 3 Final residue levels of cyprodinil in grape

表4 嘧菌环胺在土壤中的最终残留量Table 4 Final residue levels of cyprodinil in soil

3 讨论

嘧菌环胺是一种蛋氨酸生物合成抑制剂，与三唑类、咪唑类、吗啉类、苯基吡咯类等无交互抗性，具有预防和治疗作用。目前在中国已有7个农药产品取得了临时登记，每日允许摄入量(ADI)为0.03 mg/(kg·bw)。目前中国尚未制定相关农产品中嘧菌环胺的最大残留限量(MRL)。CAC残留限量标准中嘧菌环胺在葡萄上的MRL值均为3 mg/kg，日本为5 mg/kg，美国为2 mg/kg。为保障消费者的安全和促进贸易，有必要研究嘧菌环胺在中国不同典型葡萄种植区域的残留规律和最终残留量，为尽快制定其在相关作物上的MRL及评估残留风险提供理论依据。

本研究所建立的葡萄和土壤中嘧菌环胺残留分析方法检出限(0.05 mg/kg)低，前处理方法简便且效率高，完全能够满足市场监测和农药登记残留试验中嘧菌环胺残留的检测。嘧菌环胺按高低两个施药剂量，分别施药3次和4次，21 d后采样，葡萄中嘧菌环胺残留量均低于 2 mg/kg，参照 CAC(3 mg/kg)、美国(2 mg/kg)和日本(5 mg/kg)制定的葡萄中嘧菌环胺的MRL，按本试验中剂量施药21 d后采收葡萄是安全的。

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