波尔山羊黑素皮质素受体4 C端基因单核苷酸多态性与体质量的关联分析

张 俊， 钱 勇， 钟 声， 孟春花， 王慧利， 李隐侠， 曹少先

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014;2.江苏省农业科学院动物品种改良和繁育重点实验室，江苏 南京210014)

黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor-4，MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一种肽类物质［1］，单一外显子编码，为G蛋白质耦联受体超家族成员之一。研究结果表明，MC4R基因的突变与人和动物的生长、采食量、能量稳态和脂肪沉积等性状显著相关［2-5］，可作为选择动物生长性状的遗传标记。张菊等成功克隆了绵羊MC4R基因的cDNA序列［6］;张子军等克隆了安徽白山羊MC4R基因的编码区和部分 5'、3'非编码区序列［7］，但关于山羊 MC4R 基因多态性及其与生产性状关联的研究尚未见报道。为此，本研究对波尔山羊MC4R基因进行了克隆和测序，寻找波尔山羊MC4R基因的多态性位点，分析其多态性与波尔山羊体重的关联，为山羊生长性状的分子育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

164只波尔山羊样本由江苏省农业科学院六合动物实验基地统一饲养管理，营养以及管理水平保持一致。波尔山羊各月龄的体重资料均由江苏省农业科学院六合动物实验基地提供。每个个体采集耳组织样，置冰桶中带回实验室，－20℃保存。

1.2 组织DNA提取

组织DNA提取采用酚-氯仿抽提法，TE Buffer溶解后－20℃保存。

1.3 MC4R 基因扩增

根据GenBank:EU622853.2设计引物。上游引物序列:5'-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3'，下游引物序列:5'-CTGGGCACTGCTTCACATC-3'。PCR反应总体系 20.0 μl，含模板 DNA 60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 ×缓冲液 2.0 μl，添加灭菌双蒸水至 20.0 μl。PCR 反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环;72℃延伸10 min。

1.4 克隆与测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，随机选取10只波尔山羊的PCR产物用TaKaRa胶回收试剂盒回收后与PMD-19T载体连接，16℃培养过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞中，37℃培养16 h，挑选阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.5 突变位点筛选

将11个阳性克隆的测序结果与GenBank序列对比，确定突变位点。

1.6 PCR-RFLP 分析

1.6.1 目的基因扩增 根据测序结果选择MC4R C端基因片段2个突变位点(分别位于Ban II、Xsp I识别序列内)，设计2对引物(P1和P2)分别扩增MC4R基因Ban II位点序列和Xsp I位点序列，引物序列见表1。

各引物 PCR 反应总体系为 20.0 μl，含模板DNA60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 × 缓冲液 2.0 μl，添加灭菌双蒸水至20.0 μl。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，退火30 s(温度见表1)，72℃延伸时间分别为15 s、8 s，35个循环。PCR产物分别经1.5%、2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色检测扩增结果。

表1 波尔山羊MC4R基因PCR-RFLP分析选用的引物Table 1 The primers for PCR-RFLP analysis of MC4R gene in Boer goats

1.6.2 基因型的确定 采用限制性内切酶Ban II、Xsp I分别对PCR扩增产物进行酶切。酶切反应体系 16.0 μl，含 PCR 产物 4.0 μl、Ban II和 Xsp I(10 U/μl)各 0.5 μl、10 × 缓冲液 1.0 μl、灭菌双蒸水10.5 μl。37℃酶切3 h。均用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，培清JS-780全自动凝胶成像分析仪进行成像分析。

1.7 数据分析

对不同基因型的体质量采用SPSS软件中的One-Way ANOVA进行方差分析。

2 结果

2.1 MC4R基因片段的扩增结果

10只波尔山羊DNA模板分别进行MC4R基因片段PCR扩增，在1 400 bp左右得到一条特异性条带(图1)。

图1 波尔山羊MC4R基因片段的扩增结果Fig.1 PCR amplification of MC4R gene in Boer goats

2.2 多态性位点的筛选

将10只波尔山羊DNA模板扩增得到的MC4R基因片段克隆后进行测序，测序结果与GenBank序列比对后发现MC4R C端基因片段存在2个点突变(图2)，分别为编码区946 bp处A与C单碱基颠换，986 bp处C与T单碱基颠换。经分析A946C位点处于Ban II酶切位点内，C986T位点处于Xsp I酶切位点内。

图2 波尔山羊MC4R基因突变位点测序结果Fig.2 The sequencing results of mutation loci of MC4R gene in Boer goats

2.3 PCR-RFLP检测方法的建立

对164只波尔山羊样本进行PCR扩增，2对引物都获得了特异性良好的产物(图3)，用琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度与预期结果一致。分别采用相应的限制性内切酶对2种PCR产物进行消化，A946C位点经Ban II消化出现2种基因型:AA(228 bp)、AC(59 bp、169 bp 和 228 bp)(图4);C986T位点经Xsp I消化出现3种基因型:CC(22 bp、130 bp)、CT(22 bp、130 bp 和 152 bp)、TT(152 bp)(图 5)。

图3 波尔山羊MC4R基因片段PCR扩增电泳图Fig.3 Electrophoresis patterns of MC4R gene fragment in Boer goats by PCR

图4 波尔山羊MC4R基因片段Ban II酶切电泳图Fig.4 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Ban II

图5 波尔山羊MC4R基因片段Xsp I酶切电泳图Fig.5 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Xsp I

2.4 MC4R基因多态位点的群体遗传学特性

由表2可见，A946C位点只检测出2种基因型，C986T位点检测出3种基因型。A946C位点AA型居多，占79.3%;AC型较少，占20.7%;A为优势基因。C986T位点CC型居多，占95.7%;CT型和TT型较少，分别占3.7%和0.6%;C为优势基因。A946C和C986T位点在波尔山羊群体中均表现为低度多态(PIC＜0.25)，而且群体遗传杂合度较低，表明2个多态位点在波尔山羊群体中的遗传一致性较高。

表2 A946C和C986T位点的基因型和基因频率在波尔山羊群体中的分布Table 2 Distribution of gene and genotype frequency of loci A946C and C986T in Boer goats

2.5 不同基因型对波尔山羊体质量的影响

MC4R基因A946C和C986T位点与波尔山羊体质量的相关性分析见表3。结果显示:在受检的波尔山羊群体中，A946C位点2种基因型间各月龄波尔山羊体质量差异均不显著。C986T位点CT基因型个体的六月龄质量和六月龄日增质量均极显著高于CC基因型，且CT基因型个体的周岁质量和周岁日增质量均显著高于CC基因型，其他月龄体质量和日增质量差异均不显著;TT基因型因只有一个个体，无法进行差异显著性分析，但TT型各月龄体质量和日增质量均高于其他基因型。

表3 MC4R基因A946C和A986C位点不同基因型的波尔山羊体质量Table 3 Body weights of Boer goats in different genotypes of MC4R gene at loci A946C and A986C

同行同位点不同小写字母表示差异达0.05显著水平，同行同位点不同大写字母表示差异达0.01极显著水平。

3 讨论

大量研究结果表明MC4R基因在动物采食和能量平衡调控中起关键作用。MC4R基因敲除的小鼠表现出多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状［3］，人MC4R基因突变可导致遗传性肥胖。猪MC4R基因的Asp298Asn突变与猪的背膘厚、生长速度和采食量显著相关［8］，兔 MC4R基因237 bp处 A/G突变显著影响兔体质量、全净膛质量以及饲料转化率［9］。鸡MC4R基因5'调控区和编码区上的4个突变位点对鸡的体质量、屠体性状有显著影响［10］。肉牛MC4R基因单核苷酸多态性(SNPs)与其生长性状和脂肪沉积显著相关［11-13］。中国美利奴羊MC4R基因3'侧翼区的3个突变位点对其体斜长和腰角宽有显著影响［14］。但山羊MC4R基因多态性及其与生产性状关联分析尚未见报道。

通过克隆测序，我们发现波尔山羊MC4R基因编码区存在多个 SNPs，其中位于编码区末端的A946C和C986T位点分别导致I变成L(异亮氨酸→亮氨酸)和S变成F(丝氨酸→苯丙氨酸)。C端是MC4R锚定在质膜所必须的，该段序列的缺失或者突变可能引起MC4R蛋白质无法锚定到质膜，从而使其无法与配体结合，导致功能缺失［15］。本试验通过PCR-RFLP方法检测了A946C和C986T位点在波尔山羊中的多态性。结果发现A946C位点检测出2种基因型，C986T位点检测出3种基因型。A946C位点AA型居多，AC型较少，A为优势基因。C986T位点CC型居多，CT型较少，TT型只检测到1个样本，C为优势基因。

本研究还分析了A946C和C986T位点不同基因型与波尔山羊群体各月龄体质量的关联性。结果表明，波尔山羊A946C位点2种基因型间各月龄体质量差异均不显著。C986T位点CT基因型个体的六月龄质量和六月龄日增质量均极显著高于CC基因型，且CT基因型个体的周岁质量和周岁日增质量均显著高于CC基因型，其他月龄体质量和日增质量差异不显著;TT基因型各月龄体质量和日增质量均高于其他基因型，但TT基因型只有一个样本，无法进行差异显著性分析。推测在C986T位点中，T基因对山羊体质量的增加更有利。综上所述，MC4R基因C986T位点可以作为山羊体质量性状标记辅助选择的候选分子标记。

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