蒙古绵羊输卵管组织中 β-防御素表达的原位杂交技术检测

锡林高娃， 任洪宝， 曹贵方

(1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古 通辽 028400;2.内蒙古民族大学乳源性致病菌研究所，内蒙古 通辽 028400;3.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

病原微生物最初在动物机体上皮、黏膜表面增殖、入侵，由于病原特异性免疫反应相对滞后，机体必须在上皮表面对微生物进行有效杀灭，即产生非特异性免疫反应，以防止病原微生物的过量增殖造成更大危害。由于雌性动物生殖道的生理功能，必须运行有效的黏膜屏障使得精子通过，同时阻止有害微生物进入子宫及输卵管，所以非特异性免疫对于雌性生殖道至关重要。β－防御素作为来自机体自身的内源性抗菌肽，广泛存在于动物机体内，参与生物体非特异性免疫反应，具有较强的广谱杀菌功能［1-2］。为阐明蒙古绵羊β-防御素(Sheep beta-defensin，sBD-1)在输卵管组织内的表达定位，本研究拟以扩增的sBD-1 cDNA作为探针，采用RNA原位杂交技术进行检测，旨在为进一步研究sBD-1在蒙古绵羊生殖系统非特异性免疫防御机制提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及其组织

5只健康状况良好的成年蒙古绵羊由呼和浩特市回民屠宰场提供。取输卵管组织固定，HE染色，在含0.1%DEPC的4%多聚甲醛中固定4 h，然后于无RNA酶条件下进行石蜡包埋。其余迅速取样后液氮冻存。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒(Cat.NO.Z5110)购自Promega公司;RT-PCR 试剂盒(Cat.NO.DRR019A)购自大连宝生物工程公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat.NO.DP208/209)购自南京博尔迪公司;地高辛探针标记和检测试剂盒(Cat.NO.11745832910)购自 Roche 公司;DEPC、EDTA、Tris-HCl、吐温20、硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、去离子甲酰胺、鲑鱼精DNA、多聚赖氨酸、蛋白酶K、杂交专用盖玻片、尼龙膜等购自Sigma公司;融蜡箱、恒温箱、切片机及马来酸等常规试剂为本实验室提供。

1.3 方法

1.3.1 sBD-1核酸探针的合成 根据羊 β-防御素cDNA序列(GenBank登录号:U75250)设计引物(扩增产物大小为300 bp左右)P1(5'-GCCAACATGAGGCTCCATCACCTGCTCCT-3')和P2(5'-AACTTTGAACAAAATTTATTCTGGTTTAAATT-3')。提取输卵管组织总RNA并反转录成cDNA，RT-PCR扩增并回收测序验证扩增序列的真实性。对回收产物进行地高辛标记，并根据地高辛标记产物达到预期效率的测定方法对本标记产物进行测定。对比Control DNA(试剂盒提供)和地高辛标记产物形成的斑点，如果稀释为0.1 pg的斑点即第5个斑点可见，那么地高辛标记产物达到了预期的效率，可做杂交。

1.3.2 切片制备和杂交 将固定好的输卵管组织切片，贴于用多聚赖氨酸预处理的载玻片上，60℃干烤1 h。烘烤后的切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精下行至无RNase水，空气干燥约10 min;切片浸入含50 μg/ml蛋白酶K的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中，37℃ 消化6～7 min;PBS洗2次，4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS中固定1.5 min;PBS洗2次，干燥。每张切片滴加30 μl预杂交液(5×SSC，5×Denhardt，50%去离子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鲑鱼精DNA)，42 ℃预杂交1 h;轻轻倾去预杂交液，每张切片再滴加20 μl杂交液(5×SSC，5 ×Denhardt，50% 去离子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鲑鱼精DNA，10%硫酸葡聚糖，1 μl杂交液中加入3 ng sBD-1 cDNA反义探针)，盖上杂交专用盖玻片，42℃杂交20 h。2×SSC中振荡去掉盖玻片，切片顺次经2×SSC、1×SSC、0.25×SSC中室温各2×15 min;每张切片滴加30 μl封闭液，于湿盒内室温下作用30 min;轻轻倾去封闭液，每张切片滴加30 μl 1∶5 000抗地高辛AP液(Anti-DIG-AP)，湿盒内室温2 h;切片在马来酸缓冲液(0.1 mol/L马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)中室温2×15 min，在显色缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，pH 9.5)中室温10 min;每张切片滴加30 μl 1∶50的NBT/BCIP显色液，湿盒内避光显色6 h;灭菌水终止显色反应，伊红复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察，照相。阴性对照试验:杂交液中不加探针，其余步骤同上。

2 结果

将RT-PCR产物回收经电泳检测，条带单一，大小为301 bp，且cDNA含量为5 ng/μl，可用于探针制备。产物经地高辛标记，0.1 pg斑点已经显蓝色，说明标记的探针已达到预期量1 000 ng，可做杂交试验。

检测蒙古绵羊输卵管组织中sBD-1 mRNA在组织细胞内的表达情况，结果显示，应用sBD-1 cDNA地高辛标记的探针杂交，在输卵管上皮近管腔的游离面胞质内有非常强的蓝紫色的杂交信号(图1A和图1B)，而阴性对照无杂交信号(图1C和图1D)。如图1所示，sBD-1 mRNA的杂交信号主要位于输卵管黏膜层上皮细胞胞质的游离端内;肌层、外膜、固有层内均无杂交信号。这说明输卵管黏膜层上皮细胞的胞质内是表达sBD-1 mRNA的场所，而固有层、肌层、结缔组织等均不表达。

图1 蒙古绵羊输卵管上皮细胞原位杂交结果Fig.1 The expression of β-defensin in fallopiantube of Mongolian sheep by in situ hybridization

3 讨论

β-防御素作为一类大量存在于哺乳动物上皮组织内的内源性抗微生物肽，参与生物体天然免疫和获得性免疫，具有较强的广谱杀菌功能，且迄今为止尚未发现病原菌对它产生耐药性。鉴于国内外对于反刍动物雌性生殖道β-防御素研究比较缺乏，本研究检测其在输卵管组织内的表达定位，对于了解反刍动物妊娠期间防御素表达调控的基本规律及在机体防御功能方面的作用均具有重大意义。

起初，哺乳动物防御素被认为是只存在于造血细胞起源的细胞内，后来相继在人和鼠的小肠潘氏细胞内、牛舌和猪舌、肠道和气管的黏膜上皮内发现有防御素mRNA的表达［3-5］。对于绵羊雌性生殖道内的β-防御素(sBD-1)，目前鲜见相关研究报道。雌性生殖系统内的防御素的研究目前主要集中在人防御素(hBD1-3)及鼠防御素(rBD-1，rBD-2)上。Pivarcsi等研究发现，体外培养的人阴道上皮细胞能够分泌对抗病原菌感染的hBD-2［6］。Valore等通过原位杂交定位，HBD-1 mRNA在肾脏Henle环、远端小管、收集管的上皮层内表达，在雌性生殖道的输卵管、子宫、子宫颈、阴道的上皮层表达，并对大肠埃希菌等微生物均有杀灭作用，提出HBD-1是女性泌尿生殖道重要的先天免疫防御因子，对泌尿生殖道局部抗菌防御起重要作用［7］。King等通过RT-PCR技术研究发现，人子宫内膜作为先天免疫的重要场所，分泌hBD1-4、WAP蛋白对抗外源菌的侵袭从而保护机体［8］。通过RTPCR技术检测到，鼠β-防御素存在于雌性生殖道的上皮细胞内，并且起抗菌作用。陈新年等证实大鼠β－防御素基因(rBD-1，rBD-2)在皮肤、肾脏、肺脏、子宫颈等均有表达［9］。本试验通过原位杂交方法定位研究，发现在蒙古绵羊输卵管黏膜层的上皮细胞游离面的胞质内存在sBD-1表达，符合β-防御素主要表达于黏膜表面细胞的一般规律。

［1］BOMAN H G.Peptide antibiotics and their role in innate immunity［J］.Annu Rev Immunol Annu Rev Immunol，1995，13:61-92.

［2］GANZ T，LEHRER R I.Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia［J］.Semin Hematol，1997，34:343-354.

［3］THOUZEAU C，MAHO Y L，FROGET G，et al.Spheniscins:avian β-defensins in preserved stomach contents of the king penguin，Aptenodytes patagonicus［J］.Biol Chem，2003，278:51053-51058.

［4］ANNE E K，HILARY O D C，RODNEY W K.Innate immune defences in the human endometrium ［J］.Reprod Biol Endocrinol，2003，1:116.

［5］WIESENFELD H C，HEINE R P，KROHN M A，et al.Association between elevated neutrophil defensin levels and endometritis［J］.Infect Dis，2002，186(6):792-797.

［6］PIVARCSI A，NAGY I，KORECK A，et al.Microbial compounds induce the expression of pro－inflammatory cytokines，chemokines and human beta-defensin-2 in vaginal epithelial cells［J］.Microbes Infect，2005，7(9-10):1117-1127.

［7］VALORE E V，PARK C H，QUAYLE A J，et al.Human beta-defensin-1:an antimicrobial peptide of urogenital tissues［J］.J Clin Invest，1998，101:1633-1642.

［8］KING A E，FLEMING D C，CRITCHLEY H O，et al.Differential expression of the natural antimicrobials，beta-defensins 3 and 4，in human endometrium［J］.Reprod Immunol，2003，59(1):1-16.

［9］陈新年.大鼠-防御素-1基因在大鼠皮肤和肾脏固有表达［J］.中国病理生理杂志，2001，17(1):13-15.