狼尾蕨体细胞耐盐突变体筛选技术

叶晓青， 佘建明， 贾新平， 梁丽建， 尤 仙

(江苏省农业科学院农业生物技术研究所，江苏省农业生物学重点实验室，江苏 南京 210014)

蕨类植物又称羊齿植物，是植物界中的一个大群。在植物分类中，蕨类植物属于苔藓植物和被子植物之间的一个过渡类型，是维管植物进化过程中的一个关键环节。蕨类植物的生活史由2个世代交替完成，即孢子体和配子体世代。2个世代都能独立存活，这在植物界是独一无二的。蕨类植物的繁殖方式分为有性繁殖(孢子繁殖)、无性繁殖(营养繁殖)和组织培养，育种方法为引种驯化［1］。

自Nabors等［2］首次报道从烟草细胞系成功地筛选出耐盐突变体再生植株之后，目前有关植物筛选耐盐细胞系与变异体或突变体研究已有大量报道，涉及的植物种类超过40种。植物细胞进行耐盐突变体筛选，尚有待建立高效植株再生技术体系，克服耐盐细胞系难以再生完整植株的障碍和提高耐盐突变体检测效果［3］。本研究以狼尾蕨无菌苗叶片为外植体材料，在建立离体培养植株再生技术的基础上，探讨不同浓度氯化钠对叶片不定芽诱导能力的影响，试图建立氯化钠直接筛选法获得耐盐突变体再生植株的技术体系，并对体细胞突变体进行与耐盐性相关的分子检测，为开展蕨类植物细胞工程育种技术研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以狼尾蕨(Davallia bullata)无菌试管苗的叶片为外植体材料。

1.2 培养基和培养方法

基本培养基由MS大量元素、微量元素［4］和B5维生素［5］组成，添加蔗糖30 g/L，琼脂条为8 g/L。不定芽诱导培养基在基本培养基基础上附加1.0 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，不定芽生长培养基在基本培养基基础上附加0.5 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，成苗和生根培养基在基本培养基基础上附加0.2 mg/L IBA。培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。

狼尾蕨叶片诱导不定芽植株再生的培养方法详见前期报道［6］。培养室温度为(26±2)℃，光照强度为1 500 lx，光照时间为16 h。

1.3 NaCl筛选方法

在不定芽诱导培养基上加入 NaCl，NaCl浓度(质量与体积比)分别为0(对照)、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%和0.8%。采用直接筛选法，培养30 d统计不定芽的诱导率。

不定芽诱导率=诱导产生不定芽的叶片数/接种的叶片总数×100%

1.4 与耐盐性相关SSR分子标记方法

基因组 DNA提取和检测:分别取0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl浓度筛选得到的再生植株混合株的幼叶为材料，采用改良的CTAB方法提取基因组DNA。基本步骤如下:(1)取幼嫩叶片，加1%不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用液氮磨至粉状;(2)加入600 μl十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)抽提缓冲液，混匀，65℃水浴1 h;(3)冷却至室温，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀;(4)10 000 r/min离心10 min;(5)吸上清液，转入含有异丙醇的离心管内，上下摇动30 s，充分混合至能见到DNA絮状物;(6)10 000 r/min离心1 min，倒掉液体;(7)加入300 μl含有RNA酶的TE缓冲液溶解DNA，37℃恒温过夜;(8)加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，10 000 r/min离心10 min;(9)取上清液，加入 720 μl的75%乙醇及80 μl 5 mol/L醋酸钠，轻轻转动，使DNA块状物浮游于液体中;(10)放置30 min，10 000 r/min离心1 min，倒掉液体，再加入1 000 μl 70%的乙醇;(11)10 000 r/min离心 1 min，DNA沉淀自然风干，加入50～100 μl的 TE缓冲液，使DNA溶解。经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，置于－20℃冰箱保存备用。

PCR反应体系:PCR反应总体积为20.0 μl，含有 10 × PCR 缓冲液 2.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，SSR 引物组合(10 μmol/L)1.0 μl，基因组 DNA(30 ng/μl)2.0 μl，Taq DNA 聚 合 酶 (2.5 U/μl)0.2 μl，ddH2O 11.3 μl。反应在 MJ Research Thermal Cycler PTC-100PCR仪上进行，PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，32个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒压(150～200 V)电泳1 h左右，参照快速银染法对PCR产物进行银染检测［7］。

本试验所用的248个SSR分子标记，均匀分布于整个基因组和适用于麦类作物扩增的引物组合，包括248条正向引物和248条反向引物［8］。

2 结果

2.1 NaCl浓度对诱导不定芽的影响

在附加NaCl的不定芽诱导培养基上狼尾蕨叶片诱导不定芽结果显示:随着NaCl浓度的提高，接种的叶片褐化率逐步提高(图1和图2)，不定芽诱导率逐步下降。当 NaCl浓度为 0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%时，不定芽诱导率分别为80.2%、28.4%、20.6%、15.9% 和 7.8%。NaCl浓度为0.8%时，叶片彻底丧失不定芽的诱导能力(表1)。

表1 NaCl浓度对诱导不定芽的影响Table 1 Effects of NaCl concentrations on the induction of adventitious bud from Davallia bullata leaves

图1 在无NaCl培养基上诱导的不定芽Fig.1 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in NaCl-free medium

图2 在0.6%NaCl培养基上诱导的不定芽Fig.2 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in 0.6%NaCl medium

0～0.4 %NaCl浓度为一敏感区，叶片诱导不定芽频率从80.2%降至28.4%;0.6%～0.7%NaCl为另一敏感区，不定芽诱导率从15.9%降至7.8%。试验中观察到叶片经过NaCl筛选诱导产生不定芽的时间推迟3～5 d。不定芽转到无NaCl的增殖培养基上恢复正常生长，在成苗和生根培养基上可以得到完整的再生植株(图3)，其移栽成活率略低于对照。

图3 0.6%NaCl筛选得到的再生植株Fig.3 The regenerated plantlets selected with 0.6%NaCl

与以通过愈伤组织分化再生植株途径获得的愈伤组织为外植体材料相比较，通过不定芽诱导再生植株途径，以叶片为外植体材料NaCl筛选浓度总体上偏低，因此宜选用较高浓度的NaCl。以狼尾蕨无菌苗的叶片为外植体材料，0.6% ～0.7%NaCl是较为适宜的耐盐突变体筛选浓度。

2.2 与体细胞突变体耐盐性相关SSR标记

在供试的248对引物组合中，有9对引物组合在野生型狼尾蕨和耐盐突变体植株之间PCR扩增存在多态(表2)。引物WXE-56在野生型狼尾蕨中可以扩增出约1 500 bp和1 000 bp 2条特异性条带，而在经过0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl筛选获得的突变体植株中均无法扩增出以上特异性条带;在经过0.5%、0.6%和0.7%NaCl筛选获得的突变体植株中均可以扩增出约700 bp的特异性条带，并且经过0.7%NaCl筛选获得的突变体植株中还可以扩增出约600 bp的特异性条带，而在野生型狼尾蕨中均缺少以上特异性扩增条带(图4A)。引物WXE-204在野生型材料狼尾蕨中可以扩增出约600 bp的特异性条带，而在经过0.5%、0.6%和0.7%NaCl筛选获得的突变体植株中均无法扩增出该特异性条带;在经过0.5%NaCl筛选获得的突变体植株中可以扩增出约1 000 bp特异性条带，经过0.6%NaCl筛选获得的突变体植株中可以扩增出约500 bp和400 bp的特异性条带，经过0.7%NaCl筛选获得的突变体植株中可以扩增出约420 bp和450 bp的2条特异性条带，而在野生型材料狼尾蕨中均无法扩增出以上特异性条带(图4B)。因此，WXE-56和WXE-204可用作狼尾蕨体细胞耐盐突变体鉴定的适宜引物。

表2 SSR引物序列Table 2 Primer sequences used for SSR analysis

图4 耐盐性相关SSR标记的扩增结果Fig.4 Amplification results of regenerated plantlet of D.bullata by SSR markers associated with salt tolerance

3 讨论

愈伤组织是目前普通采用的植物突变体筛选的外植体材料［9-11］。耐盐突变体筛选以NaCl为筛选剂，选择方法为直接筛选和间接筛选2种方法。直接筛选法，即将愈伤组织直接置于高浓度NaCl(1.5% ～2.0%)的培养基上;间接筛选法，即从0.2%至2.5% 逐级提高NaCl浓度，将愈伤组织在每级培养基上培养1代至数代，最终获得不同抗盐水平的变异素［12］。在植物体细胞培养中，就遗传稳定性而言，国内外学者普遍认为，外植体材料通过诱导不定芽再生植株途径比经过愈伤组织脱分化再生植株途径更为适宜。以狼尾蕨的叶片与其他植物的愈伤组织作为突变体筛选材料相比较，叶片对NaCl筛选浓度的反应更为敏感。本试验中，狼尾蕨叶片在0.8%NaCl选择下彻底丧失不定芽的诱导能力，因而认为0.6% ～0.7%NaCl为适宜的筛选浓度。

简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)标记是基于PCR基础上的第二代分子标记，与其他分子标记相比，具有呈共显性、数量丰富、重复性高、稳定性好和结果可靠等优点［13］。本试验在248对适用于麦类作物扩增的引物组合中发现有9对引物在狼尾蕨野生型和耐盐突变体植株之间PCR扩增存在多态，表明SSR标记方法适用于狼尾蕨体细胞耐盐突变体分子鉴定。

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