乳汁成分对乙型肝炎病毒DNA检测的影响

汪东剑，张晓云，江丁

(中国人民解放军第一八四医院检验科，江西鹰潭335000)

乳汁成分对乙型肝炎病毒DNA检测的影响

汪东剑，张晓云，江丁

(中国人民解放军第一八四医院检验科，江西鹰潭335000)

目的探讨乳汁成分对乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）检测的影响以及乙肝病毒DNA在乳汁中的分布情况，为建立可行、标准的乳汁HBV DNA检测方法提供依据。方法建立乳汁成分干扰模型、生理盐水对照模型，比较干扰模型与对照模型中的HBV-DNA检测结果。在HBV-DNA阴性乳汁中掺入高中低值标准HBV DNA阳性血清，分别取样本乳酪层、乳清与沉淀进行HBV-DNA检测。结果乳酪、乳清、沉淀干扰模型分别与盐水对照模型比较差异均有统计学意义(t值分别为3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪、乳清、沉淀干扰模型间相互比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。在掺入高值和中值标准血清时，HBV-DNA在乳酪、乳清和沉淀中的测定结果两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中沉淀中的测定结果最高，其次为乳清，最低的为乳酪层；在掺入低值标准血清后，除乳酪与沉淀中的HBV-DNA测定结果差异有统计学意义(P<0.05)外，其余差异均无统计学意义(P>0.05)。结论乳汁主要成分对于乳汁样本中HBV-DNA的检测具有干扰作用，使得测定值低于实际值。乳汁样本中HBV-DNA主要存在于沉淀部分，乳清、乳酪中也同时存在HBV-DNA。

乙型肝炎病毒；DNA；乳汁

我国是一个乙肝大国，乙型肝炎病毒（HBV）携带者高达1.4亿。母婴传播是乙肝的重要传播途径。在我国孕妇中乙型肝炎病毒携带者为10%~20%，而母婴传播途径最活跃的因素就是乳汁传播。HBV-DNA定量检测是乙型肝炎携带者是否具有传染性的金标准，因此不少学者致力于乳汁标本中HBV-DNA的检测，以确定母乳喂养是否安全可靠[1]。然而，乳汁组成复杂，富含脂肪、蛋白质及乳糖[2]，且乳汁为浑浊非匀相液体，与血清不同，因而适用于血清标本中HBV-DNA检测的方法是否适用于乳汁标本有待探讨。目前国内尚无标准化的乳汁中HBV DNA检测程序，各学者采用的研究方法和结果不尽相同。建立标准化的乳汁中HBV DNA检测方法势在必行。本研究仅从乳汁成分对实时荧光定量检测HBV DNA的影响及HBV DNA在乳汁中分布情况着手，以期为乳汁中HBV DNA检测标准方法的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 阴性乳汁收集2012年6~12月我院妇产科分娩产妇乳汁30份，经乙型肝炎血清标志物及HBV-DNA检测均为阴性，确定乳汁中不携带乙型肝炎病毒。

1.2 标准阳性血清从2012年6~12月来我院就诊进行血清HBV-DNA检测标本中，留取30份无溶血、无黄疸、无脂血阳性标本，充分混匀后，平行进行HBV-DNA检测10次，取均值3.97×107IU/ml作为该混合血清的HBV-DNA定量值。将该混合血清分装于1.5 ml Eppendorf管备用。

1.3 方法

1.3.1 乳汁干扰实验乳汁于冰箱中静置24 h。乳汁分为三层：最上层为乳酪层（脂肪颗粒为主），中间为乳清（蛋白质、糖类为主），底部为有形成分沉淀。根据乳汁性状特点，建立乳酪干扰模型、乳清干扰模型、沉淀干扰模型如下：取HBV-DNA阴性乳汁8 ml取上中下三层各700µl于3只Eppendorf管中，每管加入标准阳性血清各700µl制成乳汁成分干扰模型；同时取无菌生理盐水700µl与700µl标准阳性血清加入Eppendorf管中制成对照模型，将四种模型充分震荡混匀备用。每种模型按照血清HBV-DNA实时荧光定量标准检测方法同时平行检测HBV-DNA10次。

1.3.2 乳汁中HBV-DNA的分布情况取标准阳性血清用无菌生理盐水稀释10、100、1 000倍，制成高、中、低三种浓度标准血清模板，每种浓度取100µl于Eppendorf管中(平行做10份)，每管分别加入900µl HBV-DNA阴性乳汁，震荡混匀，12 000转离心10 min，分别取离心后的乳酪、乳清、沉淀部分各100µl加入新的Eppendorf管中，每管加入100µl DNA浓缩液。震荡混匀后12 000转离心10 min；去上清，沉淀加入DNA提取液20µl，100℃干浴10 min；冷却后12 000转离心10 min，取上清液2µl加入PCR反应管进行扩增检测。

1.4 主要试剂和仪器HBV-DNA定量检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），达安7600 PCR扩增仪，杭州奥康K30B干式恒温器，姜堰新康XK96-B快速混匀器，上海安亭TGL-168高速离心机。

1.5 统计学方法所得数据均以均值±标准差(x-±s)表示，统计学处理用SPSS12.0软件进行，计数资料用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳汁成分干扰实验结果乳酪干扰模型、乳清干扰模型、沉淀扰模型与生理盐水对照模型比较，差异具有统计学意义(t值分别为3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪干扰模型、乳清干扰模型、沉淀干扰模型间相互比较差异无统计学意义(P＞0.05)。以生理盐水对照模型HBV-DNA检测结果为标准计算乳酪、乳清、沉淀三组干扰模型中HBV-DNA的回收率分别为43.8%、53.6%、41.0%(回收率=干扰模型HBV-DNA测定结果/对照模型HBV-DNA测定结果)×100%)，与国内文献报道不一致[3]。而三种干扰模型间相互比较差异无统计学意义(P>0.05)。乳汁干扰实验结果见表1。

表1 乳汁成分干扰实验结果

2.2 不同载量的乳汁各层HBV DNA检测结果比较在掺入高值和中值标准血清时，HBV-DNA在乳酪层、乳清和沉淀中的测定结果两两比较P<0.05，其中沉淀中的测定结果最高，其次为乳清，最低的为乳酪层；在掺入低值标准血清后，除乳酪层与沉淀中的HBV-DNA测定结果P<0.05外，其余P>0.05，见表2。

表2 不同载量的乳汁各层HBV DNA检测结果比较

表2 不同载量的乳汁各层HBV DNA检测结果比较

注：a为乳酪层与乳清比较，b为乳清与沉淀比较，c为乳酪层与沉淀比较。

组别样本类型t值P值高值中值低值乳酪层乳清沉淀乳酪层乳清沉淀乳酪层乳清沉淀结果测定值（IU/ml）(1.87±0.26)×105(3.37±1.21)×105(7.65±0.82)×105(1.94±0.49)×104(2.58±0.36)×104(3.05±0.25)×104(2.27±0.55)×103(2.67±1.11)×103(2.76±0.46)×103对数值5.27±0.07 5.49±0.22 5.88±0.05 4.28±0.11 4.41±0.06 4.48±0.04 3.35±0.11 3.39±0.20 3.44±0.08 3.58a7.17b8.40c2.84a2.82b6.03c1.58a0.92b4.78c<0.05a<0.05b<0.05c<0.05a<0.05b<0.05c>0.05a>0.05b<0.05c

3 讨论

国内对于乳汁HBV-DNA检测的研究大多集中于乳汁中携带乙肝病毒与母乳喂养安全方面，且对于乳汁中HBV DNA检测的方法并不一致，对于检测结果的准确性难以衡量。本次研究旨在探讨乳汁成分对HBV-DNA检测是否具有影响以及乙肝病毒颗粒在乳汁中分布的情况，以期为建立可行、标准的乳汁标本HBV-DNA检测方法提供依据。

目前国内外大多临床实验室采用实时荧光定量PCR检测HBV-DNA，其试剂及操作程序仅相对于血清样本。由于乳汁中含有大量脂肪颗粒、蛋白质、上皮细胞及其他有形成分，使得我们对于乳汁样本HBV DNA的检测不能简单的按照血清样本的检测方法进行。

我们首先考虑的是乳汁样本成分的复杂性是否会影响样本中HBV-DNA的检测。为此，我们收集HBV-DNA阴性的乳汁标本，经自然沉淀后，分别在乳酪层、乳清、沉淀中掺入等量标准阳性血清制成干扰模型，以无菌生理盐水掺入等量标准阳性血清制成对照模型。通过测定四种模型中的HBV-DNA，我们发现，三种干扰模型中HBV DNA的测定结果与对照模型相比，P<0.05，结果差异具有统计学意义。同时计算三种模型中HBV-DNA的回收率，发现三种模型的回收率分别为43.8%、53.6%、41.0%，同样反映出乳汁主要成分对于乳汁样本中HBV-DNA的检测具有干扰作用，使得测定结果低于实际值。但是，三种干扰模型的结果相互比较，发现彼此间差异无统计学意义(P>0.05)。由此认为，乳汁中对HBV DNA检测的影响是共性的，经自然沉淀后所形成的三层主要成分对于HBV DNA检测具有相似的干扰作用。乳汁成分对HBV-DNA检测的干扰作用可能作用于以下环节：(1)在HBV-DNA的浓缩沉淀过程中，由于乳汁中富含的脂肪和蛋白质和有形物质，使浓缩液无法完全将样本中所含的核酸完全沉淀，从而使部分核酸随离心后的上清液被遗弃导致检测结果偏低。(2)由于乳汁中含有大量蛋白质、糖类，使得乳汁的比例大于血清样本，我们所使用的12 000转离心所产生的离心力不足以使乳汁中存在的核酸完全沉淀，一部分随离心后上清液被遗弃导致检测结果偏低。(3)在核酸抽提过程中，由于我们浓缩沉淀过程中收集到的沉淀数量较多，使加入的DNA提取液不能完全抽提沉淀中HBV DNA，离心后部分HBV-DNA仍然存在于沉淀中，无法进入上清液，导致检测结果偏低。(4)乳汁样本中富含的脂类物质、蛋白未被完全处理，随着HBV-DNA模板一起进入到PCR反应体系进行扩增，从而产生抑制作用，使得检测结果偏低。(5)由于乳汁中乳糖含量丰富，而多糖是一类PCR抑制物[4]，使得乳汁样本中HBV DNA的检测结果偏低。有研究将乳汁中所含的脂肪颗粒作为影响乳汁样本HBV-DNA检测的主要因素[5]，而本次试验中，脂肪颗粒含量最高的乳酪干扰模型与乳清、沉淀干扰模型中HBV-DNA的检出结果差异并不存在统计学意义，说明脂肪颗粒是影响HBV-DNA检测的因素之一，但不是决定性影响因素，乳汁样本对于HBV-DNA检测的影响是由脂肪颗粒、乳清成分（蛋白质、糖类）以及乳汁中的有形成分共同造成的。

大多数学者认为乙肝病毒在乳汁中分布是不均匀的，但对于是主要分布在乳清还是沉淀部分存在争议[6-7]。在本次研究中，我们对于掺入高中低三种标准阳性血清进行分析，分别检测其乳酪层、乳清及沉淀中的HBV-DNA含量，发现沉淀中HBV-DNA含量最高，其次为乳清，乳酪层最低，三者之间差异具有统计学意义(在掺入低值血清的乳汁中，乳酪层与乳清，乳清与沉淀间差异无统计学意义，但乳酪层与沉淀间的差异具有统计学意义)。通过乳汁中HBV-DNA分布情况的研究，我们认为乳汁是一类特殊的样本，即不同于血清均匀分布，又不同于其他体液完全集中于沉淀中，我们在临床检测中，以乳清或者沉淀替代乳汁整体来进行HBV-DNA检测都是不可取的，并不能真实反映整个乳汁样本中的HBV-DNA载量。

对于乳汁中HBV-DNA的检测，即要充分考虑乳汁成分对于检测的影响，又要考虑到HBV DNA在乳汁中的分布特点。而文献报道中所采用的检测方法往往只顾及其中一种因素甚至没有考虑这些因素[8-9]，因此，有必要对乳汁样本中HBV-DNA检测的方法进行研究和改进，使得我们得到的结果能真实反映出待测样本中HBV-DNA的载量。

[1]张春和,金艳,郭爱兰,等.产妇乳汁HBV标志物含量、HBV-DNA载量相关性与母乳喂养安全性的研究[J].现代检验医学杂志,2009,24(5):108-110.

[2]韩立强,庞坤,刘爱清,等.郑州市妇女乳汁中营养及活性成分的测定[J].郑州大学学报(医学版),2010,45(1):59-61.

[3]周丽琴,尤建飞,吕时铭.586例乙肝病毒携带产妇乳汁HBV-DNA的检测及分析[J].浙江医学,2005,27(11):816-821.

[4]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2011:71.

[5]余道军,胡兰兰,吴盛海,等.乳汁样本乙肝病毒DNA提取方法探讨[J].国际流行病学传染病学杂志,2010,37(2):91-94.

[6]王华忠,何学贤,谭可为,等.标本前处理方法对乳汁HBV DNA检测的影响[J].检验医学与临床,2010,7(14):1419-1422.

[7]温旺荣,苏芳,吴勇,等.乳汁处理方法对检测HBV DNA结果的影响[J].临床检验杂志,2007,25(1):31.

[8]彭其才,许成芳,滕奔琦,等.产妇血清HBV DNA含量对乳汁和新生儿血清HBV DNA浓度的影响[J].中山大学学报(医学科学版),2010,31(5):729-730.

[9]李国航,庄桂龙,瞿志军,等.乙肝孕产妇血清HBV-DNA与乳汁HBV-DNA相关性的比较[J].临床和实验医学杂志,2012,11(12): 953-954.

Influence of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA.

WANG Dong-jian,ZHANG Xiao-yun, JIANGDing.DepartmentofClinicalLaboratory,theNo.184HospitalofthePLA,Yingtan335000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the influence of the compositions of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA and the distribution of HBV-DNA in the human breast milk,and to provide the basis to set up a feasible and standard method for the quantitative detection of HBV-DNA in the human breast milk.MethodsWe set up the models interfere with cheese,whey,sediment and the compared model of physiological saline,and contrasted the HBV-DNA quantitative detection of interferential-model with compared-model. Then we mixed the high-value,mid-value and low-value standard HBV-DNA positive serum with HBV-DNA negative breast milk,and detected the HBV-DNA load in the cheese,whey and sediment.ResultsContrasted the HBV-DNA quantitative detection of the cheese interferential-model,whey interferential-model,sediment interferential-model with the physiological saline compared-model,the value of t were 3.30,3.00 and 4.60,and the value of P were less than 0.05.Contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese interferential-model,whey interferential-model and sediment interferential-model,the value of P were greater than 0.05.In the condition of mixed negative breast milk with high-value and mid-value standard serum,contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese,whey and sediment,the value of P were less than 0.05,and the quantity of HBV-DNA in the sediment was highest,in the whey was secondly and in the cheese was lowest.In the condition of mixed negative breast milk with low-value standard serum,the value of P were greater than 0.05 except the value of P contrasted between cheese and sediment was less than 0.05.ConclusionThe compositions of human breast milk can interfere the quantitative detect of HBV-DNA,which makes the estimated value less than the actual value.The HBV-DNA mostly exists in the sediment,also in the cheese and whey.

Hepatitis B virus;DNA;Human breast milk

R512.6+2

A

1003—6350（2013）16—2409—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.16.0993

2013-02-27）

张晓云。E-mail:w2013wdj184@163.com