高效液相色谱法测定算盘子中牡荆素含量

唐 哲 ，韦少宣 ，廖厚知

（1.中国人民解放军第303医院药剂科，广西 南宁 530021； 2.广西中医学院药学院中药教研室，广西 南宁530021； 3.广西汇科药物研究所，广西 南宁 530007）

算盘子 Glochidion puberum（Linn.）Hutch.为大戟科植物，又名橘子草、蝉子草、西瓜树、果合草、血泡木等，全株入药，味微苦、涩，性凉，有小毒，归大肠、肝、肺经，具清热利湿、解毒消肿之功，主治湿热泻痢、黄疸、淋浊、带下、发热、咽喉肿痛、痈疮疖肿、漆疮、湿疹、虫蛇咬伤[1]。牡荆素为算盘子的有效成分之一，具有多种生理活性，临床可用于治疗心血管疾病，且具有防癌抗肿瘤、抗炎、解痉、降压等作用[2]。本研究中建立了牡荆素的含量测定方法，旨在为算盘子的质量标准制订提供实验室依据。现报道如下。

1 仪器与材料

LC－2010A型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；SPDM10Avp紫外检测器（日本岛津制作所）；AB265－S型分析天平（梅特勒－托利多）；UV－2450型分光光度计（日本岛津制作所）；SG8200HBT型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）。牡荆素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111687－200602）；乙腈为色谱纯、盐酸、冰乙酸均为分析纯；算盘子药材分别采自广西玉林地区（G1）、桂林地区（G2）、百色地区（G3）、河池地区（G4）、柳州地区（G5）、梧州地区（G6）、南宁地区（G7），购于广西玉林药市（G8）、柳州中药材市场（G9）、南宁中药材市场（G10），植物样本由广西汇科药物研究所工程师廖厚知采集并鉴定为大戟科算盘子属算盘子 Glochidion puberum（Linn.）Hutch.，标本存放于广西汇科药物研究所药用资源标本室。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:岛津 Thermo BDS Hypersil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱:YWG C18保护柱（10 mm × 4.6 mm）；流动相:乙腈 － 0.2% 冰乙酸溶液（22 ∶78）；流速:1.0 mL／min，柱温:室温；检测器:日本岛津SPD－M10Avp紫外检测器，检测波长为340 nm。理论板数按牡荆素计不低于3000，此条件下牡荆素与其他成分分离度不低于1.5。

2.2 溶液制备

精密称取牡荆素对照品适量，加乙腈制成每1 mL含30 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定，置 100 mL具塞锥形瓶中，加石油醚（60～90℃）50 mL，超声波振荡30 min，过滤，残渣挥干石油醚，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声波振荡60 min，放冷，再次称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按确定的色谱条件测定。在此条件下，样品中牡荆素的理论板数为3894，分离度为2.1，与其他成分分离良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密称取牡荆素对照品10.23 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取 1，2，3，4，5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。按上述色谱条件，分别进样10 μL，测定，以峰面积积分值（Y）对牡荆素进样量（X，μg）进行回归分析，得回归方程Y＝320033X＋ 24790，r＝0.9998(n＝5)。结果表明，牡荆素进样量在0.1023～0.5115 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验:取牡荆素对照品溶液（30.69 μg ／mL），按上述色谱条件，依法操作测定，重复进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD为0.39%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一批样品（G1）溶液 10 μL，依法制备供试品溶液，在 2，4，6，8，24，48，72 h 时间隔进行分析，测定色谱峰面积。结果的 RSD为0.55%(n＝7)，表明供试品溶液制备后72 h内稳定。

重复性试验:取同一批号样品6份（G1），依法制备供试品溶液，测定含量进行分析。结果平均含量为 2.413 mg／g，RSD为1.80%，表明测定方法重复性好。

加样回收试验:取已知准确含量（2.413 mg／g）的样品 6份（G1），每份取 0.25 g，精密称定，置 100 mL 量瓶中，精密加入 0.6 mL牡荆素对照品溶液（1.011 g／L），挥去甲醇，按供试品溶液制备方法制备，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件下测定牡荆素峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 牡荆素加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取算盘子10批，按上述方法测定，结果表明，广西不同产地的算盘子中牡荆素含量在0.1286% ～0.3917%之间，平均含量为 0.2296% ，见表 2。

表2 样品含量测定结果（n＝10）

3 讨论

算盘子作为广西民间一味常用道地药材，但其相关文献报道较少，目前还没有其质量控制的相关报道。为此，本研究中以算盘子中牡荆素的含量作为测定指标，建立方法，旨在为算盘子药材的质量控制提供含测依据。

流动相选择:参考相关文献[2－5]，试验比较了甲醇 －水溶液（40 ∶60）、乙腈 －0.5% 甲酸溶液（20 ∶80）、乙腈 －3% 醋酸溶液（11 ∶89）、乙腈 －1% 醋酸溶液（14 ∶86）、乙腈 － 0.2% 冰乙酸溶液（22∶78），前两种流动相的分离度均达到要求，但流动相甲醇 －水溶液（40∶60）的峰形不够好，流动相乙腈 －0.5%甲酸溶液（20∶80）峰形稍有拖尾，牡荆素出峰时间相对较晚，后两种流动相出峰时间均在35 min以上，且峰形不好。流动相乙腈 －0.2%冰乙酸溶液（22∶78）得到的牡荆素峰形好，对称，保留时间适宜，且分离度达到分析要求，故选择。

提取溶剂选择:去除杂质时考察了石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、三氯甲烷，三种溶剂，结果石油醚（30～60℃）提取液颜色稍浅，石油醚（60～90℃）与三氯甲烷提取溶液颜色无明显差异。考虑三氯甲烷对环境的破坏，故放弃，选择石油醚（60～90℃）作为杂质的去除溶剂。提取溶剂考察了甲醇、乙醇，结果在超声提取的条件下，乙醇提取不完全，而甲醇则有着很好的提取率。

提取方法选择:比较了加热回流、索氏提取、超声提取3种方法。结果3种提取方法提取的牧荆素含量无明显差异，考虑超声提取方法简单、易于操作、耗时少等优点，选择超声提取法。

提取时间选择:考察了除杂后甲醇超声提取30，60，90 min，结果60 min与90 min无明显差异，并对样品提取后残渣进行了再次提取及高效液相色谱法测定，结果无待测组分特征峰出现，说明甲醇超声60 min已提取完全。

[1]王国才，梁洁平，王 英，等.算盘子的化学成分[J].中国天然药物，2008，6（4）:251 － 253.

[2]罗娅君，边清泉，陈 佳，等.HPLC法测定牧荆中牡荆素的含量[J].广西植物，2011，31（3）:418 －421.

[3]谭瑞璞，刘海周，梁晓原.HPLC法测定千针万线草中牧荆素的含量[J].云南中医学院学报，2009，32（4）:28 － 32.

[4]仲 英，杨尚军，王 菊，等.高效液相色谱法测定山楂叶总黄酮中牧荆素含量[J].时珍国医国药，2000，11（10）:871 －872.

[5]陈 化.高效液相色谱法测定小叶榕中牧荆素的含量[J].时珍国医国药，2008，19（9）:2122 － 2123.