超声辅助酸水解提取山里红叶中牡荆素的工艺优化

邢文淼 陈 民 冯昌寅 孟宪明 田梦飞 牟璠松 罗 猛

(东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040)

山里红(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)蔷薇落叶小乔木，山楂的一个变种，既是果树，也是观赏植物[1～2]。主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、河南、山东、江苏、陕西、山西等地[3]。山里红果实具有消食化积，行气散瘀之功效[4]。另有记载其叶片具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的作用[5]。山里红叶中含有多酚、三萜、花青素和有机酸等多种成分[6～8]。目前已从中分离得到的酚类化合物有绿原酸，牡荆素-4″-O-葡萄糖苷，牡荆素-2″-O-鼠李糖苷，荭草苷，芦丁，牡荆素和金丝桃苷[9～10]。现代药理学研究表明，牡荆素在增加冠状动脉的血流量、保护心血管、降低血脂、防止脑缺血导致的中风、减轻性功能障碍和治疗过敏性哮喘方面具有重要作用，但其在山里红叶中的含量较低[11～15]。研究表明，山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷，牡荆素-2″-O-鼠李糖苷含量较高，所以可通过水解反应提高牡荆素含量[16～17]，以提高山里红叶提取物活性。

本文利用单因素实验对山里红叶超声提取过程中影响牡荆素得率的主要影响因素盐酸浓度、超声功率、提取时间、固液比、超声温度、乙醇浓度进行优化。同时，研究了它们与牡荆素提取得率之间的规律趋势；然后，应用正交设计优化试验，研究了盐酸浓度、提取时间、固液比和超声功率对山里红叶提取得率的影响大小，并确定最佳提取工艺，为其综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

山里红叶样品采自东北林业大学，标本收集于东北林业大学教育部森林植物生态学重点实验室。牡荆素标准品购于上海融合制药技术有限公司；四氢呋喃(色谱级)购自Mreda Technology Inc，Made In USA；乙腈(色谱级)购自Dikma，Made In USA；磷酸(分析纯)购自西陇化工股份有限公司；甲醇(色谱级)购自Dikma，Made In USA；盐酸(分析纯)购于天津市天力化学试剂有限公司。超纯水由Milli-Q净水系统制得。

1.1 样品预处理

采收到的山里红叶样品于恒温通风干燥箱40℃干燥至恒重后，细粉、过60目筛，4℃下保存备用。

1.2 牡荆素含量的测定

使用KQ-250DE超声提取器进行样品提取，将提取液浓缩，离心后取上清液，使用安捷伦1260型高效液相色谱仪，Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相组成：四氢呋喃-乙腈-水-磷酸(175∶30∶790∶0.38，V/V/V/V)。流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL，紫外检测波长为350 nm。配制浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的牡荆素标准品，绘制牡荆素标准品曲线。测定山里红叶提取物中牡荆素含量[18]。

1.3 单因素实验

1.3.1 盐酸浓度

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸浓度0、1、2、3、4 mol·L-1。提取温度50℃，超声功率500 W，提取时间30 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.3.2 提取时间

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸浓度2 mol·L-1，提取温度50℃，超声功率500 W，提取时间10、20、30、40和50 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.3.3 固液比

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，加入50%的乙醇溶液，酸浓度2 mol·L-1，提取温度50℃，超声功率500 W，提取时间30 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.3.4 超声功率

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸浓度2 mol·L-1，提取温度50℃，超声功率400，500，600，700和800 W，提取时间30 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.3.5 超声温度

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸浓度2 mol·L-1，提取温度30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，超声功率500 W，提取时间30 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.3.6 乙醇浓度

准确称量叶片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液，酸浓度2 mol·L-1，提取温度50℃，超声功率500 W，提取时间30 min，将提取液过滤，重复3次。用2.2牡荆素含量的测定方法测定牡荆素的含量。

1.4 正交试验

通过对单因素实验结果的分析，可知超声温度和乙醇浓度对牡荆素得率的影响较小。故选择影响较大的因素盐酸浓度、提取时间、固液比和超声功率进行正交试验(表1)。

表1 正交试验因素水平

1.5 数据处理

实验重复3次。实验数据采用Design-Expert 8.0.6软件分析(State-Ease公司，美国明尼苏达州)。方差分析可表明超声辅助提取法的拟合模型是否显著。P<0.05时，即可认定为该模型与数据拟合适度。

2 结果与讨论

2.1 山里红叶中牡荆素提取工艺优化

当盐酸浓度为2 mol·L-1时(图1A)，牡荆素得率最高。盐酸浓度再升高，牡荆素得率呈现下降趋势。原因是盐酸浓度越高水解效果越好，当盐酸浓度达到2～3 mol·L-1时，牡荆素-4″-O-葡萄糖苷和牡荆素-2″-O-鼠李糖苷已大部分转化为牡荆素，酸浓度过高会破坏物质本身结构，2 mol·L-1盐酸浓度为最佳实验条件。不同提取时间对牡荆素得率影响见图1B，随着时间的增加，牡荆素得率呈上升趋势，但当提取时间超过30 min后，牡荆素得率略下降，这可能是在超声波作用下，牡荆素在30 min左右达到了平衡，而后随着时间的增加，其他物质杂质相继溶出，故选择提取时间30 min。在设置的固液比范围内，牡荆素得率随着溶剂量的增加而增大，当固液比达到1∶20时，继续增加溶剂量，牡荆素得率反而会下降(图1C)。由于继续增加溶剂量只会增加多糖化合物等杂质的浸出，影响牡荆素得率，故选择固液比1∶20。随着超声功率的增加，牡荆素得率先增加，在超声功率达到500 W，牡荆素含量达到最大值，继续提高超声功率，得率缓慢下降(图1D)。可能的原因是，随着功率的上升，温度升高，溶剂溢出，降低牡荆素的提取率，故超声功率选择为500 W。在设定的提取温度范围内，得率以50℃为分界线，出现先高后降的趋势(图1E)。原因可能是温度变高会导致蛋白质等脂溶性物质不断溶出，体系黏度升高，抑制牡荆素类物质溶出，降低得率[14]。故选择提取温度为50℃。随着乙醇浓度的增加，牡荆素得率呈上升趋势，当乙醇浓度在50%时，继续增加乙醇的浓度，牡荆素得率反而会下降(图1F)。原因可能是乙醇浓度大于50%时，脂溶性的物质溶解度增加，对牡荆素的溶出造成影响。故选取乙醇浓度为50%。

图1 几种因素对牡荆素得率的影响Fig.1 Effect of four factors on the vitexin

表2 牡荆素得率变化绝对值与对应影响因素

Table 2 Absolute value of the yield of vitexin and corresponding factors

影响因素Factors得率变化范围Range of yield variation(mg·g-1)得率变化绝对值Absolute value of yield change(mg·g-1)变化幅度Amplitude of variation盐酸浓度HCl concentration0.085～2.4672.38228.023超声功率Ultrasonic power1.245～2.6011.3561.089提取时间Extraction time0.094～1.6781.58416.85固液比Solid-liquid ratio1.247～2.4351.1880.953超声温度Ultrasonic temperature1.254～2.3091.0550.841乙醇浓度Ethanol concentration1.925～2.5340.6090.316

表3 正交试验结果

2.2 正交试验因素选择

在单因素实验中，牡荆素得率与各影响因素如表2所示。乙醇浓度对牡荆素得率影响变化范围是1.925～2.534 mg·g-1，得率变化的绝对值为0.609 mg·g-1，影响的变化幅度为0.316，与其他因素相比，对牡荆素得率影响较小，可以直接选取乙醇浓度50%为最佳实验条件。同理，超声温度对牡荆素得率影响也比较小，超声温度对牡荆素得率影响变化范围是1.254～2.309 mg·g-1，得率变化的绝对值为1.055 mg·g-1，影响的变化幅度为0.841，与盐酸浓度、超声功率、提取时间和固液比相比，超声温度对牡荆素得率的影响较小。所以在正交试验中选取影响因素相对较大的因素：盐酸浓度、超声功率、提取时间和固液比进行正交试验。

表4 正交试验方差分析

2.3 山里红叶提取牡荆素正交试验

山里红叶提取牡荆素得率的影响，在各个因素条件中，盐酸浓度具有较大显著性。因素影响顺序为：盐酸浓度>超声功率>提取时间>固液比，结果见表3～4。说明盐酸浓度在超声辅助提取山里红叶的过程中起着首要作用。正交优化后的最优提取条件为A2B3C2D2，即盐酸浓度2 mol·L-1，提取时间40 min，固液比1∶20，超声功率500 W。为验证正交试验，在最佳条件下进行3次试验，牡荆素平均得率为2.603 mg·g-1。

3 结论

设计单因素试验，研究了各个因素条件对牡荆素得率的影响，在此基础上，通过设计正交优化试验得到最优工艺。结果表明：影响牡荆素提取得率的因素顺序为：盐酸浓度>超声功率>提取时间>固液比；最优工艺条件为：盐酸浓度2 mol·L-1、超声功率500 W、提取时间40 min、固液比1∶20，在此最优组合条件下，测定牡荆素得率为2.603 mg·g-1。