绿豆皮牡荆素提取工艺优化及其抗氧化活性研究

杜冠尚，罗 磊，张向辉，夏迎利，段雪莹

（河南科技大学，河南洛阳 471000）

0 引言

绿豆（Mung Bean，简称M.），别名青小豆，蝶花亚科豇豆属，在中国已有2 000多年栽培史[1]，年产量约70万t。绿豆皮是绿豆深加工过程中由于去皮或去渣产生的废弃物，约占绿豆质量的8%左右[2]。这些绿豆皮或加工为廉价饲料或被丢弃，未得到有效利用，造成大量资源浪费。研究表明，绿豆皮含丰富的黄酮、膳食纤维、蛋白质等营养成分，抗氧化抑菌消炎功能远高于绿豆[3-5]。

牡荆素（Vitexin），碳苷黄酮活性单体[6-7]，其显著的抑菌能力[8-9]、抗氧化活性[10-12]和神经保护作用[13]引起国内外学者的广泛关注。牡荆素的提取大多从檀香叶、山楂叶、金银花中提取[14-17]，这些原料本身牡荆素含量少，且提取成本高。而绿豆皮产量丰富，主要抗氧化成分为牡荆素，含量超过绿豆皮黄酮的50%[18-19]，可作良好的牡荆素提取替代原料。目前，关于绿豆皮黄酮[20]、膳食纤维[21-23]、叶绿素[24]的报道较多，缺乏绿豆皮牡荆素深入研究。

牡荆素溶于有机溶剂，但绿豆皮质地坚硬，单纯利用有机溶剂提取较难。超声提取操作简便、效率高，近年来广泛应用于功能性成分的提取[25-27]。超声波引起的机械振动加速反应进程，绿豆皮细胞壁在碰撞摩擦中软化，促进有效成分溶出。因此，采用超声波辅助有机溶剂提取绿豆皮牡荆素，进一步研究其抗氧化活性，为牡荆素提取提供新来源，实现绿豆皮废物利用，为绿豆皮资源综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆皮（干燥过筛备用），实验室自制；牡荆素标准品（HPLC≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源叶生物科技有限公司提供；铁氰化钾，洛阳市创伟化玻有限公司提供；三氯乙酸，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；水杨酸，天津市风船化学试剂科技有限公司提供；邻苯三酚，上海永叶生物科技有限公司提供；三羟甲基甲烷（Tris Base），上海强顺化学试剂有限公司提供。

Eclassical3100型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司产品；FA1006型分析天平，上海科学仪器设备有限公司产品；KQ-500DE型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；SNWTZ-5N型冷冻干燥箱，北京新芝生物仪器有限公司产品；HH-S6A型水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；FZ102型粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司产品；Eclassical3100型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司产品；HL-2B型数显恒流泵，上海驰唐电子有限公司产品；101型电热鼓风干燥箱，北京科委永兴仪器有限公司产品；TDZ5-WS型和H1750型式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，1.7 μm）；紫外检测器波长278 nm，柱温25℃，进样量20 μL，流速1.0 mL/min；流动相：A为水（0.5%甲酸），B为乙腈（色谱级）；梯度洗脱条件：0～3 min，5%B；3～6 min，10%B；6～9 min，15%B；9～12 min，20%B；12～15 min，25%B；15～20 min，30%B；20～25 min，20%B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.2.2 绿豆皮牡荆素提取及测定

准确称取一定量绿豆皮粉于100 mL具塞三角瓶，按比例加入70%乙醇，超声处理提取，以转速4 800 r/min离心20 min，将上清液旋蒸浓缩后加4倍体积无水乙醇静置，再次以转速10 000 r/min离心30 min，过膜（0.22 μm），于波长278 nm处测定峰值，代入牡荆素标准曲线（Y=41.997X+16.217，R2=0.999 5），计算提取量。

式中：Y——峰面积；

V——浓缩后体积，mL；

m——样品质量，mg；

5——稀释倍数。

1.2.3 绿豆皮牡荆素提取工艺研究

以牡荆素提取量为指标，考查料液比（1∶3，1∶5，1∶7，1∶9，1∶11，1∶13）、超声温度（35，40，45，50，55，60 ℃）、超声时间 （10，20，30，40，50，60 min）、超声功率 （200，250，300，350，400，450 W）对提取量的影响。响应面优化超声条件，将各因素设为3个水平。

响应面优化设计因素与水平设计见表1。

表1 响应面优化设计因素与水平设计

1.2.4 绿豆皮牡荆素体外抗氧化活性研究

提取液旋蒸浓缩至有淡黄色晶体析出，真空冷冻干燥成粉（即绿豆皮牡荆素）备用。总还原能力测定及计算参照文献[28]，DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力测定分别参照文献[29]、文献[30]、文献[31]。

2 结果与分析

2.1 超声提取结果

2.1.1 超声提取单因素试验结果

超声条件对牡荆素提取量的影响见图1。

图1 超声条件对牡荆素提取量的影响

由图1可知，绿豆皮牡荆素提取量随料液比增大而增加，比例1∶9时，提取量为1.903 mg/g，继续加大溶液比例提取量增加缓慢。溶剂多，物质间传质动力大，牡荆素易溶出，溶剂过多会延长浓缩时间，因此1∶9为最佳料液比。牡荆素提取量随超声温度升高，增速先快后慢并有下降趋势，提取温度为50，55℃时提取量分别为1.916，1.926 mg/g，本着节能高效原则选择50℃为最佳温度。牡荆素提取量随超声时间延长先增加后下降，40 min时有最大提取量1.936 mg/g。细胞内外存在浓度梯度差，短时超声为牡荆素溶出提供动力；长时超声产生的热能和空化效应会破坏牡荆素的化学结构，因此最佳超声时间为40 min。随超声功率的增加，提取量先增加后下降。超声功率为350 W时绿豆皮牡荆素提取量最大为1.936 mg/g。功率越大，溶剂体系的机械振动越强，牡荆素溶出越快；功率过大空化泡大量积聚，阻碍超声波在料液之间的传递，因此350 W为最佳超声功率。

2.1.2 响应面优化超声提取结果

用Design Expert 8.0.5.0软件中Box Behnken进行响应面优化试验。将数据进行多元回归拟合，方程为：

超声波提取绿豆皮牡荆素响应面试验结果见表2，超声波提取绿豆牡荆素响应面试验结果方差分析见表3。

表2 超声波提取绿豆皮牡荆素响应面试验结果

表3 超声波提取绿豆牡荆素响应面试验结果方差分析

由表3可知，CD交互作用极显著（p＜0.01）、BD交互作用较显著 （p＜0.05）、模型极显著（p＜0.01）、失拟项不显著（p＞0.05），模型设计合理。模型决定系数R2=0.986 7，说明模型能解释98.67%响应值变化，拟合程度较好；因变量与自变量之间复相关系数R2Adj=0.973 4，说明该模型能较好地反映绿豆皮牡荆素提取量与各因素之间的关系。F值越大，表明该因素对试验指标越重要，各因素对牡荆素提取量的影响顺序为D＞C＞B＞A。

2.1.3 响应面交互作用分析

二次模型所做出的响应面可以评价试验因素对绿豆皮牡荆素提取量的交互作用，并由此确定最佳水平范围。响应值越大，各参数等高线呈椭圆形，两因素交互作用越显著。

各因素交互作用对绿豆皮牡荆素提取量影响的响应面及等高线图见图2。

由图2可知，超声时间和超声功率、超声温度和超声功率间等高线图均为椭圆，对结果影响极显著（p＜0.01），前者交互作用较后者显著，与表3方差分析回归模型显著性检验结果一致。

理论最优组合为料液比1∶8.88，超声温度49.36℃，超声时间45.71 min，超声功率339.86 W，提取量为1.958 mg/g。为便于操作，将最优组合调整为料液比1∶9，超声温度50℃，超声时间46 min，超声功率350 W，验证最优组合得平均提取量为1.966 mg/g，优化模型合理。

牡荆素标品（左） 及粗提液（右） HPLC图见图3。

图2 各因素交互作用对绿豆皮牡荆素提取量影响的响应面及等高线图

由图3可知，牡荆素粗提液与标准品出峰时间分别为14.728 min和14.739 min，说明提取成分为牡荆素。

2.2 绿豆皮牡荆素体外抗氧化活性分析

2.2.1 绿豆皮牡荆素总还原能力测定结果

图3 牡荆素标品及粗提液HPLC图

总还原力测定是利用铁离子在酸性条件下化合价变化所引起的颜色变化来判断的，颜色越深，吸光值越大，还原能力越强。

绿豆皮牡荆素总还原能力见图4。

图4 绿豆皮牡荆素总还原能力

由图4可知，在0.03～0.18 mg/mL内，随质量浓度增加，绿豆皮牡荆素总还原力呈上升趋势。质量浓度为0.18 mg/mL时，绿豆皮牡荆素吸光值为0.813，达到维C吸光值1.329半数以上。

2.2.2 绿豆皮牡荆素DPPH自由基清除结果

DPPH·结构中含有的孤对电子与自由基清除剂结合，颜色由深紫色变成淡黄色，褪色程度与DPPH自由基有定量关系。

绿豆皮牡荆素DPPH自由基清除能力见图5。

由图5可知，在质量浓度0.03～0.18 mg/mL内，绿豆皮牡荆素清除自由基能力呈上升趋势，质量浓度为0.18 mg/mL时，清除率为70.49%，接近同浓度下维C清除率92.34%。两者DPPH自由基清除的IC50分别为0.119，0.036 mg/mL。

图5 绿豆皮牡荆素DPPH自由基清除能力

2.2.3 绿豆皮牡荆素羟基自由基清除结果

H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+反应生成的·OH 与水杨酸结合生成的2,3-二羟基苯甲酸于波长510 nm处有特殊吸收，加入抗氧化剂与水杨酸争夺羟基自由基，从而减少显色物质生成。

绿豆皮牡荆素羟基自由基清除能力见图6。

图6 绿豆皮牡荆素羟基自由基清除能力

由图6可知，绿豆皮牡荆素质量浓度在0.03～0.18 mg/mL时，自由基清除率与其浓度呈明显正相关，质量浓度为0.18 mg/mL时，清除率61.36%，相当于0.09 mg/mL下维C的清除率。两者·OH清除的IC50分别为0.132，0.069 mg/mL。

2.2.4 绿豆皮牡荆素超氧阴离子清除结果

邻苯三酚在弱碱性条件下自氧化生成超氧阴离子自由基和于波长325 nm处有特征吸收峰的中间产物，抗氧化剂加入后迅速与O2-·反应阻止中间产物聚集，因此吸光度值的大小可以间接反映物质的抗氧化能力。

绿豆皮牡荆素超氧阴离子清除能力见图7。

由图7可知，质量浓度在0.03～0.12 mg/mL时，绿豆皮牡荆素超氧阴离子清除率上升迅速，质量浓度大于0.12 mg/mL时清除率上升缓慢，质量浓度为0.18 mg/mL时，清除率达到63.28%。绿豆皮牡荆素和维C清除O2-·的IC50分别为0.127，0.034 mg/mL。

3 结论

图7 绿豆皮牡荆素超氧阴离子清除能力

采用超声波醇法提取绿豆皮牡荆素，用响应面法建模分析。结果表明，在提取液为70%乙醇条件下，料液比1∶9，超声温度50℃，超声时间46 min，超声功率350 W，有最大提取量1.966 mg/g，试验误差小，模型拟合较好。4种抗氧化试验均表明绿豆皮牡荆素有较好的抗氧化能力，对不同的自由基，有不同的清除能力。粗提液中牡荆素HPLC色谱图虽然与牡荆素标品保留时间一致，但仍有杂峰干扰，后期将对粗提液进行纯化处理，提高纯度。