系统性红斑狼疮患者外周血B淋巴细胞中狼疮活动相关miRNA的筛选

陈芳，陈朝生，章慧娣，薛向阳，丁晓凯，孙莉，陈丹，黄朝兴

（温州医学院，浙江 温州 325000，1.附属第一医院 肾内科；2.微生物学与免疫学教研室；3.附属第一医院 风湿科）

microRNA（miRNA）是一类广泛存在于生物体内由约22个碱基组成的内源性非编码RNA分子，在转录后水平通过与mRNA上靶基因的互补配对而对其表达进行负调控，导致靶基因翻译抑制或降解[1]，最终影响分子信息通路及细胞表面膜分子的表达等生物学作用。已有文献[2-4]报道miRNA在免疫细胞的分化发育、免疫应答调控、免疫系统疾病的发生发展等过程中发挥重要作用。而系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种较为常见的自身免疫性疾病，异常B淋巴细胞产生自身抗体为该病发病的关键，但尚鲜有文献直接关注到miRNA与SLE患者外周血B淋巴细胞异常相关的研究。本研究首次在重度活动期狼疮患者外周血B淋巴细胞中筛选与狼疮活动相关的miRNA，从miRNA角度对B淋巴细胞参与SLE发病的机制进行探索。

1 材料和方法

1.1 一般资料 选取2011年2-12月本院门诊及住院的SLE患者66例，均符合1997年美国风湿病学会修定的SLE诊断标准，按SLE疾病活动指数（SLEDAI评分）分为：稳定期组（SLEDAI≤4分）20例，男1例，女19例，年龄28～52岁，平均（39.75±10）岁，其中曾用激素（甲强龙500 mg，连用3 d）冲击治疗2例，甲强龙80～160 mg 4例，40～79 mg 10例，＜40 mg 4例；重度活动期组（SLEDAI≥15分）46例，男3例，女43例，年龄23～50岁，平均（36.8±13）岁，其中曾用激素（甲强龙500 mg，连用3 d）冲击治疗4例，甲强龙80～160 mg 6例，40～79 mg 25例，＜40 mg 11例；合用免疫抑制剂或雷公藤治疗29例；健康对照组10例，男1例，女9例，年龄26～50岁，平均（38±12）岁。所有研究对象均对相关研究知情同意。

1.2 主要仪器和试剂 抗体（Biotinylated Human B Lymphocyte Enrichment Cocktail，5.0 mL）、磁珠（Streptavidin Particles Plus-DM，5.0 mL）、10×buffer 100 mL（BD公司），磁体（BD IMagnetTM），分选管（BD FalconTM），流式细胞仪（FC500 Beckman）；trizol（Invitrogen公司），全自动酶标仪（ELX800，宝特公司），电泳仪（biorad美国）；逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green Realtime PCR Master Mix Plus（TOYOBO公司），miRNA引物（Invitrogen公司），7500 Realtime PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 分离外周血中B淋巴细胞：采集所有研究对象外周静脉血5 mL，EDTA抗凝，1500 r/min离心10 min，去上清后加入1640培养基稀释至10 mL混匀，采用密度梯度离心分离法，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），收集的PBMCs用2 mL红细胞裂解液裂解残留红细胞，再用0.9%氯化钠溶液洗涤两次。按磁珠法阴性分选CD19+B细胞：用无菌蒸馏水将10×buffer稀释为1×；在所得PBMCs中加入1×buffer 0.1 mL，用细胞计数板在光学显微镜下计数，用1×buffer将细胞浓度调至10×106个/mL，按BD公司产品说明书步骤操作，所得的B细胞经流式细胞仪验证纯度。

1.3.2 提取B细胞总RNA：收集的B淋巴细胞，1000 r/min离心7 min，弃去上清液，再在离心管中加入1 mL trizol。根据trizol Regent的操作步骤提取单个样本总RNA。将每组中单个样本所提的RNA均混成一份组总RNA，应用全自动酶标仪测定其浓度及纯度，电泳仪检测其完整性。将各组剩余总RNA分成两部分，一部分用于芯片分析，另一部分用于验证芯片分析结果。

1.3.3 芯片分析：选用Affymetrix microRNA 2.0 Array芯片，该芯片采用了Sanger miRBase 15.0版序列，探针长度25个碱基，设计覆盖了20162条miRNA。利用Poly（A）聚合酶给miRNA样品加Poly（A）尾，按Flash Tag Biotin HSR Ligation标记试剂盒的说明进行miRNA荧光标记和纯化。按照说明配置杂交液，将孵育好的杂交液注入芯片中，加样口用贴纸封住；然后将芯片放在杂交炉里，48 ℃60 r/min杂交16 h。杂交结束后，用枪头吸掉杂交液，洗脱后扫描，将图像转化为基于荧光强度的数字信号（Affymetrix 7G/TG Scanner），随后进行数据分析和处理。

1.3.4 Realtime PCR法验证芯片结果：从芯片结果中随机挑出差异有统计学意义的2条miRNA（hasmiR-181a、hsa-miR-103），运用Realtime PCR技术检测其在芯片分析各组样本中的表达情况，验证芯片分析结果的可靠性。

1.3.4.1 miRNA特异性茎环引物逆转录反应：dNTP（2.5 mmol/L）1μL，5×RT Buffer 4μL，miRNART茎环引物（1μmmol/L，序列见表1）2μL，总miRNA 4μg，Reverse transcriptase MMLV反转录酶（10 U/μL）0.5μL，RNase Inhibitor RNA酶抑制剂（40 U/μL）0.5μL，Nuclease-free Water无RNA酶水补齐20μL。16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min在PCR扩增仪进行RT反应。

1.3.4.2 Realtime PCR：按TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix Plus说明书，将 miRNA特异性上下游引物特异性正、反向引物（见表1）加入反应体系。将上述PCR反应溶液置于7500 Realtime PCR仪上两步法[95 ℃，10 min；40个PCR循环（95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）]进行相对定量PCR反应。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS15.0软件进行统计学分析，数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪分析磁珠分选的B细胞 分离前PBMC中B细胞所占比例为3.47%～9.12%，经磁珠法阴性分选得到的B细胞，平均纯度约为96%（见图1）。

图1 流式细胞仪示磁珠分选后细胞（左：分离后的淋巴细胞；右：B细胞在分选后淋巴细胞的比例）

2.2 每组所提总RNA的浓度、纯度及完整性 分光光度计测定每组总RNA的浓度符合要求，OD260/280值在1.9～2.1之间。从每组总RNA各吸取约500 ng的RNA，用1.5%的甲醛变性凝胶电泳（120 V）15 min，在凝胶成像仪（JS-380A）上可检测到每组总RNA中完整的5 s、28 s和18 s条带。

2.3 miRNA在SLE重度活动期组、SLE稳定期组及正常对照组中的差异表达 对比SLE重度活动期组和SLE稳定期组患者外周血B细胞中miRNA芯片表达谱，发现SLE重度活动组中存在70条差异有统计学意义的miRNA。从上述70条差异miRNA中挑出文献报道与B细胞增殖分化相关或满足以下两个条件者为最终实验结果：①其在SLE重度活动期组中表达与正常对照组相比，差异亦有统计学意义，且上调、下调趋势与上述结果平行（见表2）；②其在SLE稳定期组与正常对照组间表达差异无统计学意义（见表2）。最终实验结果见表3。

图2 Realtime PCR溶解曲线（a）及扩增曲线（b）

表2 SLE重度活动期组及稳定期组的外周血B淋巴细胞中miRNA较正常对照组的差异表达倍数

表3 SLE重度活动期组较稳定期组外周血B淋巴细胞中差异表达的miRNA

2.4 Realtime PCR结果 图2a示3条引物的熔解曲线呈单峰状，证实所用miRNA引物特异性高，无非特异性条带扩出；使用RNU6为内参，将扩增曲线（见图2b）转化成Ct值后用2-△△Ct法计算出相对定量结果，对两组进行统计分析。同样发现在SLE重度活动期组患者中has-miR-181a、hsa-miR-103表达水平明显低于SLE稳定期患者（P＜0.05），与芯片分析结果近似。具体结果见图3。

图3 Realtime PCR示差异miRNA在SLE重度活动期组及SLE稳定期组的表达情况

3 讨论

SLE是一种以产生多种自身抗体为特征的自身免疫性疾病，临床表现多样，常涉及多种组织器官损害。病因仍不十分清楚，普遍认为由遗传、环境等多因素共同作用所致[5]。目前文献[6-10]报道miRNA与SLE的发病密切相关。Dai等[6]发现在SLE患者外周血中有7种miRNA表达水平较正常对照组明显降低，9种miRNA表达升高；对比II型狼疮肾炎（LN）组和正常对照组肾组织miRNA表达水平，发现在LN患者肾组织中30个miRNA表达明显下调，36个miRNAs表达显著上调[7]。Tang等[8]进一步研究证实SLE患者miR-146a表达水平下降，活动期患者下降更明显。miR-146a通过抑制I型IFN传导通路的关键蛋白以阻断该通路，表达下调将导致抑制作用减弱，且SLE亚洲患者miRNA-146a低表达与编码miRNA-146a的基因序列rs57095329上G等位点有关，该点与转录因子Ets-1亲和力下降，而Lfgren发现欧洲患者与单核多态（the single-nucleotide polymorphisms，SNPs）中rs2431697有关[9-10]。可见miRNA作为免疫系统精细的调节工具[11]，SLE患者较正常对照组相比不同组织所表达的差异miRNA不同，不同人种患者所表达miRNA亦有差异。另有研究表明miRNA-21和miRNA-148a在CD4+ T细胞中高表达，直接或间接结合靶基因抑制甲基转移酶1表达，导致细胞低甲基化[12]。

本研究选取SLE重度活动期患者外周血B淋巴细胞为研究对象，SLE稳定期患者为对照，首次在SLE重度活动期狼疮患者外周血B淋巴细胞中筛选与狼疮活动相关的miRNA。实验通过将每组单个样本外周血B淋巴细胞中所提RNA混总进行组间芯片分析，以减少个体差异的影响；通过挑选的差异miRNA满足以下条件：在SLE重度活动期组与正常对照组间表达差异亦有统计学意义，而在SLE稳定期组与正常对照组间表达差异无统计学意义，以尽量减少激素及免疫抑制剂对结果的影响。实验最终筛选出16条与狼疮活动相关差异表达的miRNA，其中下调10条（miR-103、miR-26a、miR-191、miR-150、miR-17、miR-155、miR-92a、miR-181a、miR-221、miR-222），上调6条（miR-1249、miR-1224-3p、miR-2116-star、miR-4258、miR-1915、miR-220b）。对这些miRNA进一步的研究和分析，不仅将加深对其狼疮活动相关表达谱特征的认识，也将促进其在SLE活动及发病机制研究中应有价值的发挥。

在文献报道中上述16条差异表达miRNA除miR-181a、miR-1224-3P外，余14条在其与SLE相关性研究中尚少有涉及，而且下调的miR-181a和上调的miR-1224-3P在Te等[13]研究的EB病毒转染SLE患者与非SLE对照组B细胞株miRNA表达谱对比中，却分别表现为下调和上调，与本实验结果相反。分析原因可能为：①研究对象不同；②SLE患者外周血B淋巴细胞为多细胞因子等共同作用结果，不能等同于EB病毒转染的SLE患者B细胞；③部分实际存在差异表达的miRNA在尽量减少药物影响的前提下被剔除。

但本实验筛选出的差异miRNA（如miR-181a、miR-150、miR-155）在其他研究[14-18]中特别是B淋巴细胞增殖活化中起着重要的作用。miR-181a是最先发现具有调节免疫细胞发育功能的miRNA，在造血干细胞及祖细胞中过表达可导致B细胞数量显著上升而T细胞下降，提示miR-181a主要调节淋巴细胞的分化[14-15]。miR-155在T细胞及B细胞的活化中起着重要的调节作用，过表达将会产生淋巴系白血病或高度分化的淋巴瘤[16]，基因敲除实验发现小鼠体内原始B细胞数目减少而成熟B细胞数量正常，但产生抗体能力明显降低。正常情况下，miR-150在祖细胞中不表达而仅存在于成熟淋巴细胞中[17]，其通过靶向作用于转录因子c-Myb显著减少成熟淋巴细胞生成及增殖分化，敲除miR-150小鼠的B细胞拥有更高的抗体分泌能力，与本实验中miR-150在SLE重度活动期患者中低表达相一致。同时动物实验证实miR-150异常表达仅影响到B细胞，对T细胞没有影响[18]。提示SLE患者活动期B细胞异常分化产生自身免疫反应抗体，可能与这些miRNA下调有关。

综上所述，SLE患者病情活动性与B淋巴细胞中miRNA异常表达密切相关，我们将对芯片初筛结果进行单个样本验证，同时进一步研究相关差异miRNA的靶基因功能，从miRNA角度阐明B淋巴细胞参与SLE活动及发病的机制，为今后从miRNA角度寻找到治疗SLE特异性强而不良反应少的新型靶向药物奠定基础。

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