采用冰冻切片和冷场发射电镜构建APA微囊的膜厚度及膜表面测定的方法研究

傅红兴，李慧，朱雁林，赵应征，吴岚岚，江玲

（温州医学院 药学院，浙江 温州 325035）

海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠微囊（Alginate-Poly-L-lysine-Alginate microcapsule，APA微囊）因其具有良好的生物相容性和免疫隔离效果，在细胞移植治疗相关疾病的研究中有广泛的报道[1-3]。但文献中虽然对其强度、生物相容性和移植效果有较多报道[4-5]，对微囊膜厚度及囊内、外表面结构研究报道较少。

冰冻切片工艺能将微囊在湿状态下固定，再将其切成5～10μm厚度的薄片，通过显微镜可观察到微囊切面，可直接测定囊膜的厚度；冷场发射方法可在冻干后微囊表面喷涂铂金，在电子束作用下观察材料表面或断面的细微结构。

本研究采用冰冻切片和冷场发射方法构建了APA-Ca和APA-Ba微囊的囊膜厚度和膜表面结构测定方法，为进一步研究改进微囊制作的配方和工艺，提供了良好的质量评价方法。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 试剂：海藻酸钠（分析纯，上海精析化工科技有限公司，本实验室纯化后使用）；聚左赖氨酸（PLL，WT：15000，Sigma，美国）；氯化钙（分析纯，华盛化工试剂有限公司）；氯化钡（分析纯，西陇化工股份有限公司）；冰冻胶（OCT，Jung，美国）；枸椽酸钠（分析纯，苏州工业园区东方化工厂）；无菌0.9%氯化钠溶液（市售，医用无菌）；其余试剂也均为分析纯。

1.1.2 仪器：高压静电发生器（GF-II型，苏州市亘晟涂装工程有限公司）；微量注射泵（WZ-50CZ，浙江大学医学仪器有限公司）；冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂）；冰冻切片机（CM1990，LEICA）；冷场发射机（JSM-6700F，日本电子）。

1.2 实验方法

1.2.1 APA微囊的制备：为提高海藻酸钠纯度和生物相容性，采用文献[6]报道方法对其进行纯化。采用本实验室已有方法进行微囊制备[7-8]：1.8%海藻酸钠溶液滴入带磁力搅拌的100 mmol/L的氯化钙（或20 mmol/L的氯化钡）溶液中，形成不溶性海藻酸钙（或钡）微胶珠，调整电压和针头离液面高度，使胶珠直径为0.5～0.7 mm，0.9%氯化钠溶液洗涤后，将上述胶珠投至0.05% PLL溶液中反应5 min，0.9%氯化钠溶液洗涤后将胶珠与0.15%海藻酸钠反应5 min，最后将胶珠用55 mmol/L的枸椽酸钠液化囊心，0.9%氯化钠溶液洗涤后即得APA-Ca（或APA-Ba）微囊。

1.2.2 微囊膜厚度的评价：采用冰冻切片结合光学显微镜方法：将微囊滴至玻片上，加5%亚甲蓝溶液染色1 min，然后将微囊放至涂有冰冻胶的冷冻切片盘上，在-22 ℃下切片，厚度为5μm；将切片迅速移至光学显微镜下拍照和计算染色的囊膜厚度。

本实验同时测定了APA微囊用RPMI1640在37℃孵育30 d后的膜厚度，每2 d换液，并与新制备的微囊膜厚度进行比较。

1.2.3 微囊膜表面的评价：采用冻干工艺结合冷场发射方法：取制备好的APA微囊，-20 ℃预冻，在真空下冻干后，再至真空条件下喷铂金，用冷场发射扫描电镜观察微囊膜表面结构。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计学软件，所有数据采用±s表示，并采用成对样品t检验进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APA微囊光镜下结果 APA-Ca和APA-Ba微囊在光镜下均显示为球形囊状结构，大小均匀，圆整，粒径为500～700μm，如图1所示。

图1 APA微囊（×100）

2.2 微囊膜厚度结果 采用冰冻切片结合光学显微镜观察得到的囊膜切片结果如图2所示。

图2 微囊膜结构图

由图2可知，微囊经亚甲蓝染色后囊膜切面及厚度在显微镜下显示清晰，呈蓝紫色，同一微囊的膜厚度显示并不均一，且APA-Ca微囊膜内、外面较APA-Ba囊膜粗糙。

2.3 微囊培养30 d前后囊膜厚度的变化结果 制备的微囊在RPMI1640溶液中37 ℃培养30 d前后囊膜厚度测定结果见表1。

表11 .8%海藻酸钠制备的微囊培养30 d前后囊膜厚度的变化

由表1结果可知，新制备的APA-Ca微囊膜厚度较APA-Ba微囊膜厚度大，差异有统计学意义（P＜0.05），可能与氯化钙分子量较小，较易进入海藻酸钠内部与其发生交联反应有关；但孵育30 d前后，两种微囊的膜厚度变化差异均无统计学意义（P＞0.05），可见微囊膜稳定性较好。

2.4 囊膜表面结构观察 新制备的APA-Ca和APABa微囊经冷冻干燥，在真空下喷铂金后，进行冷场发射扫描电镜观察，结果如图3所示。

图3 经冷冻干燥和冷场发射扫描电镜得到的微囊膜表面结构图

由图3可知，两种微囊外表面均较光滑、致密；APA-Ca微囊在冷冻干燥后有较多裂缝，通过裂缝得到膜的厚度为450～690 nm，且囊内膜较粗糙；APABa微囊膜表面无破裂，仅有部分褶皱，通过电子束轰击后得到其断面，测定膜厚度约为335 nm。

3 讨论

文献关于微囊膜厚度及囊内、外表面结构研究仅有少量报道，如Ma等[9]采用计算方法估算膜厚度，Strand等[10]采用囊膜材料嫁接异硫氰酸荧元素（FITC）后激光共聚焦测定膜厚度和Constantinidis等[11]用核磁共振测定膜厚度及表面等，均存在误差较大或对设备和材料的要求较高等问题；采用冰冻切片结合显微镜观察测定微囊膜厚度方法简单，结果准确。

APA-Ca微囊在冻干时表面易脆裂，而APA-Ba微囊表面无脆裂，显示APA-Ba微囊膜强度较高。

图4 APA-Ca-FD150光镜和荧光显微镜下结果

本研究也发现，即使同一微囊其囊膜厚度也并非均匀，可能与Ca2+、Ba2+、PLL等交联剂与各胶珠在表面反应的时间和程度不均有关。为验证囊膜不均匀，本实验组制备了包裹荧光蛋白FD150的APACa微囊，其在光镜和荧光显微镜下所示微囊中荧光蛋白显色弱（见图4红色箭头），可能为囊膜局部破裂导致荧光蛋白的释放。

本项目研究为进一步开发和研究APA微囊，探索微囊的理化性质，奠定了基础。

[1] Lim F, Sun AM. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas[J]. Science,1980, 210(4472):908-910.

[2] Souza YE, Chaib E, Lacerda PG, et al. Islet transplantation in rodents. Do encapsulated islets really work?[J]. Arq Gastroenterol, 2011, 48(2):146-152.

[3] Kitzmann JP, Law L, Shome A, et al. Real-time assessment of encapsulated neonatal porcine islets prior to clinical xenotransplantation[J]. Xenotransplantation, 2012, 19(6):333-336.

[4] Darrabie MD, Kendall WF Jr, Opara EC. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules[J].Biomaterials, 2005, 26(34):6846-6852.

[5] Schaffellner S, Stadlbauer V, Stiegler P, et al. Porcine islet cells microencapsulated in sodium cellulose sulfate[J]. Transplant Proc, 2005, 37(1):248-252.

[6] De Vos P, De Haan BJ, Wolters GH, et al. Improved biocompati-bility but limited graft survial after purification of alginate for micro-encapsulation of pancreatic islets[J].Diabetologia, 1997, 40(30):262-270.

[7] 徐艳艳, 傅红兴, 赵应征, 等. 载红细胞海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊的制备及质量评价[J]. 温州医学院学报, 2010,40(5):465-468.

[8] 严春晓, 郑伟, 傅红兴. 微囊化新生大鼠卵巢组织体外及异体移植[J]. 细胞生物学杂志, 2006, 28(5):763-767.

[9] Ma X, Vaeek I, Sun A. Generation of alginate-poly-l-lysinealginate (APA) biomicrocapsules: the relationship between the membrane strength and the reaction conditions[J]. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 1994, 22(l):43-69.

[10]Strand BL, Morch YA, Espevik T, et al. Visualization of alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules by confocal laser scanning microscopy[J]. Biotechnol Bioeng, 2003, 82(4):386-394.

[11]Constantinidis I, Grant SC, Celper S, et al. Non-invasive evaluation of alginate/poly-L-lysine/alginate microcapsules by magnetic resonance microscopy[J]. Biomaterials, 2007,28(15):2438-2445.