应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

王桂荣 付育红 梁倩 尚媛媛 姜广路 赵立平 于霞 陈素婷 黄海荣

·论 著 ·

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

王桂荣 付育红 梁倩 尚媛媛 姜广路 赵立平 于霞 陈素婷 黄海荣

目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的多重PCR方法。方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增，扩增产物分别为473 bp、235 bp和136 bp。应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定。结果 经多重PCR扩增后进行凝胶电泳，MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见，NTM标准株仅见136 bp片段。312株MTBC临床分离株中，310株扩增出473 bp和235 bp片段，敏感度为99.36%（310/312），特异度为99.32% （294/296）；300株NTM临床分离株中，294株扩增出136 bp片段，敏感度为98.00%（294/300），特异度为100.00%（310/310）。结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM，具有高度的特异度和敏感度，有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段。

分枝杆菌，结核； 分枝杆菌属； 多重聚合酶链反应

结核病的主要致病菌是结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC），然而近年来非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染亦呈不断上升趋势［1］。MTBC与NTM在临床上引起的疾病难以区别，但两者治疗方案明显不同［2］。因此，快速准确地鉴定MTBC与 NTM，对结核病的早期诊断、早期治疗，以及对结核病疫情的控制均具有重要意义。

传统的分枝杆菌鉴定方法操作繁琐、费时，且对分类密切相关的菌种难以区分。虽然在临床标本的检测中分子生物学方法不能替代培养法，但它们的互相结合可加速分枝杆菌的实验室诊断。Mokaddas等［3］根据MTBC成员（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）的oxyR基因都存在天然突变，无活性，而在NTM中oxyR基因无突变，是一个有功能的基因，在2007年选用oxy R-ahpC基因间隔区和rpoB基因的可变区建立了一种鉴定MTBC与NTM的多重PCR方法，用常见细菌、真菌，包括大肠埃希菌、沙门菌、弯曲杆菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和烟曲菌和少量分枝杆菌标准株评价了该方法的特异性，并应用少量分枝杆菌临床株对此方法进行了验证。本研究根据参考文献［3］优化了Mokaddas所建立的方法，简化了操作步骤，并应用56株分枝杆菌标准菌株和612株分枝杆菌临床分离株评估了所建立的快速鉴定MTBC与NTM多重PCR方法的可靠性。

材料和方法

一、菌株来源

6株MTBC标准株和50株NTM标准株均由首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室保存（表1）；312株MTBC临床分离株和300 株NTM临床分离株来自首都医科大学附属北京胸科医院住院和（或）门诊患者。312株MTBC临床分离株中176株来自肺结核患者，136株来自骨结核患者；300株NTM临床分离株中130株为胞内分枝杆菌，71株为脓肿分枝杆菌，32株为堪萨斯分枝杆菌，25株为偶然分枝杆菌，20株为鸟分枝杆菌，12株为戈登分枝杆菌，4株为M.arupense，2株为M.holsaticum，1株为副瘰疬分枝杆菌，1株为瘰疬分枝杆菌，1株为玛尔摩分枝杆菌，1株为诺卡分枝杆菌。

菌株分离培养方法参照文献［4］。MTBC和NTM临床分离株的鉴定依靠含对硝基苯甲酸（PNB）罗氏培养基生长试验确定，对300株NTM临床分离株通过测定基因16S rDNA、rpoB和16S-23s rRNA ITS（转录间隔区）的序列进行菌种鉴定［5-7］。

二、主要仪器和试剂

PCR仪为美国ABI公司9700型；凝胶成像仪为BIO-RAD公司Gel Doc 2000型；PCR试剂及DNA Ladder均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

三、方法

1.细菌DNA的制备：刮取一接种环新鲜培养的分枝杆菌至200μl灭菌去离子水中，煮沸15 min；离心半径5 cm，12 000 r/min，离心10 min，取上清备用。

2.PCR引物设计：根据文献［3］设计了3对分枝杆菌特异性引物，1对为针对MTBC的oxy R-ahpC基因间隔区的特异引物：IGRF和IGRR；应用该引物，以MTBC为模版可扩增出473 bp的目的片段，而以NTM为模版则无扩增产物；另外2对分别为针对MTBC和NTM的rpoB基因可变区的特异性引物，MTBC特异性引物为MTBCF和MTBCR，扩增产物为235 bp；NTM特异性引物为NTMF 和NTMR，扩增产物为136 bp。具体见表2。

表1 56株分枝杆菌标准株

3.PCR扩增及电泳：Mokaddas等所建立的方法中采用50μl PCR反应体系，并应用梯度PCR法，该方法所需试剂较多而且耗时长，对仪器的要求也较高。本研究通过摸索建立了25μl PCR反应体系，包括Extaq PCR mix 12.5μl，3对引物各1μl（每条浓度为10 pmol/μl），DNA模版2μl及去离子水4.5μl。并建立了两步PCR扩增方法，条件为：94℃5 min、94℃1 min、68℃1 min，反应30个循环，72℃延伸10 min，4℃保存，该扩增方法大大缩短了检测时间。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯检测。

表2 引物的具体序列和片段长度

结 果

1.标准菌株检测结果：应用此种多重PCR方法检测分枝杆菌DNA，其结果与预期相同：6株MTBC标准株均可见473 bp和235 bp的特异性扩增片段；50株NTM标准株可见136 bp的特异性扩增片段，结果见图1。

图1 分枝杆菌标准株多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳结果

图2 96株NTM临床分离株多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳结果

2.临床分离株检测结果：312株MTBC临床分离株中，310株扩增出与 MTBC标准株相同的473 bp和235 bp片段，敏感度为99.36%（310/312），特异度为99.32%（294/296）；300株NTM临床分离株中，294株扩增出与NTM标准株相同的136 bp片段，敏感度为98.00%（294/300），特异度为100.00% （310/310）。

6株NTM临床分离株的多重PCR扩增结果与基因测序鉴定结果存在不一致，其中2株NTM临床分离株扩增出了473、235和136 bp 3条片段，4株扩增出了473和235 bp 2条片段，结果见图2。对这6株NTM临床分离株进行进一步的同源基因测序联合结核分枝杆菌MPB64抗原胶体金检测试剂盒检测（结果未显示），结果表明这6株NTM临床分离株均存在NTM与结核分枝杆菌混合感染。

讨 论

传统的生化方法可用于鉴别MTBC与NTM，但操作繁琐，费时费力，已很少使用。近年来，国内外已有一些文献报道应用PCR或PCR相关技术快速检测、鉴别MTBC与NTM。然而，有些方法却易产 生 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果［8-10］，如IS6110同源序列不仅存在于MTBC中，也存在于溃疡分枝杆菌、浅黄分枝杆菌等6种NTM中和肺炎链球菌、Pyogenes链球菌、fumigatus曲霉菌中，同时发现某些结核分枝杆菌菌株缺乏IS6110插入序列，前者可能是用PCR扩增该靶基因序列检测鉴定MTBC产生假阳性的原因之一，后者则是产生假阴性的原因之一。核酸杂交诊断分枝杆菌（如商品化的INNO-LiPA Mycobacteria和Accu-Probe）特异度高，但成本昂贵，并且目前能鉴定的菌种有限，因此上述方法难以在常规实验室推广应用［11-12］。对分枝杆菌的目的基因如16S rDNA［5］、rpoB［6］、hsp65［13］、sec A［14］和16S-23S rRNA转录间隔区（ITS）［7］进行DNA测序几乎可将所有分枝杆菌鉴定至种水平，然而对所有临床样品都进行DNA测序成本太高，在发展中国家还很难推广。因此临床急需建立一种简单、便宜、可信的初步鉴别MTBC与NTM的方法，然后再根据需要对样品进一步鉴定至种水平，这样既可提高鉴定速度又可节约成本。

由于所有MTBC成员（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）的oxyR基因都存在天然突变，导致在MTBC中oxyR基因无活性，而在NTM中oxy R基因无突变是一个有功能的基因［15］。Mokaddas等［3］在2007年选用oxy R-ahpC基因间隔区和rpoB基因的可变区建立了一种鉴定MTBC与NTM的多重PCR方法。Mokaddas等［3］应用常见细菌和真菌验证了该方法的特异度较高，表明此3对引物在常见细菌和真菌（大肠埃希菌、沙门菌、弯曲杆菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌和烟曲菌）中无扩增产物，而在MTBC菌株中可扩增出473 bp和235 bp片段，在NTM菌株中可扩增出136 bp片段。同时也检测了该方法的敏感度，当模版中最低含有20 pg的DNA，相当于4000个分枝杆菌时，即可获得阳性扩增结果，说明该方法敏感度高。本研究所使用的多重PCR方法与Mokaddas等［3］所建立的方法原理一致，但简化了操作步骤，优化了反应条件，如用普通PCR方法替代了梯度PCR，用两步PCR法代替了三步PCR法，在未降低反应的敏感度和特异度的情况下，节约了成本，缩短了检测时间。

对于存在混合感染的样品，应用本研究中的多重PCR方法理论上应能扩增出473、235和136 bp 3条片段，但由于样品中NTM与结核分枝杆菌混合比例不同，也可能仅出现473和235 bp 2条片段，或是仅出现136 bp 1条片段。因此，当应用该方法对临床样品进行鉴定时，若出现与其他鉴定方法结果不一致时，应考虑存在混合感染的情况。

应用本研究中的3对引物鉴定MTBC临床分离株的敏感度为99.36%，特异度为99.32%；鉴定NTM临床分离株的敏感度为98.00%，特异度为100.00%，说明该方法具有较高的敏感度和特异度。另外整个试验操作简单，可以在几小时内完成，并且所使用的试剂非常便宜，使得该技术具有很高的可行性。

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［2］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al.Tuberculosis. Lancet，2003，362（9387）：887-899.

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［4］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006.

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Study on rapid differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex from non-tuberculous mycobacteria by a multiplex PCR

WANG Gui-rong，FU Yu-hong，LIANG Qian，SHANG Yuan-yuan，JIANG Guang-lu，ZHAO Li-ping，YU Xia，CHEN Su-ting，HUANG Hai-rong. National Tuberculosis Clinical Laboratory，Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Institute，Beijing Chest Hospital，Capital Medical University，Beijing 101149，China

HUANG Hai-rong，Email：hairong.huangcn@gmail.com

Objective To establish and evaluate a multiplex PCR technique to rapid differentiate Mycobacterium tuberculosis complex（MTBC）from non-tuberculous mycobacteria（NTM）.Methods Three pairs of oligo nucleotide primers were used in the multiplex PCR reaction.A 473 bp DNA fragment encoding oxyR-ahpC intergenic region in MTBC，a 235 bp and 136 bp DNA fragment encoding variable rpoB gene region from MTBC and NTM，respectively，were amplified.The multiplex PCR was assessed in 6 reference strains of MTBC，50 reference strains of NTM，312 clinical strains of MTBC and 300 clinical strains of NTM.Results The multiplex PCR produced two DNA fragments at the size 473 bp and 235 bp for MTBC reference strains，and one DNA fragment with the size 136 bp for NTM reference strains.Among 312 MTBC clinical samples，the sensitivity was 99.36% （310/312）and specificity was 99.32%（294/296）.Among 300 NTM clinical samples，the sensitivity and specificity were 98.00%（294/300）and 100.00%（310/310）respectively.Conclusion The multiplex PCR can differentiate MTBCand NTM efficiently，and might be a valuable technique for clinical use.

Mycobacterium tuberculosis； Mycobacterium； Multiplex polymerase chain reaction

2013-03-26）

（本文编辑：张晓进）

北京市自然科学基金（7132049）

101149首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室

黄海荣，Email：hairong.huangcn@gmail.com