氯胺酮对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠NF-κB的影响

姜金玉 郑贤军 孔高茵 张 宇

（湖南省人民医院麻醉科，湖南 长沙 410005）

氯胺酮对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠NF-κB的影响

姜金玉 郑贤军 孔高茵 张 宇

（湖南省人民医院麻醉科，湖南 长沙 410005）

目的 探讨氯胺酮对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠NF-κB的影响。方法 60只健康雄性SD大鼠，随机分为对照组，SAP组和氯胺酮干预组（KTM组），每组20只。应用逆行胰胆管泵注5%牛磺胆酸钠诱导大鼠重症急性胰腺炎。氯胺酮干预组术后腹腔给予4mg/kg氯胺酮。造模后12h检测肺湿重干重比，肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒细胞百分比，并应用原位杂交法检测造模后6h，12h肺组织NF-κB p65mRNA的表达。结果 NF-κB p65mRNA在SAP时除肺泡的细胞质内有表达外，出现细胞核内表达，随时间的延长表达逐渐增加，KTM组NF -κB p65mRNA的表达明显下降。结论 NF-κB活化与SAP的肺损伤密切相关，氯胺酮可以通过抑制NF -κB p65mRNA的表达起到肺保护作用。

胰腺炎；核因子-κB；氯胺酮

急性肺损伤（ALI）甚至急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是重症急性胰腺炎（（Severe acute pancreatitis，SAP）常见并发症，尤其是继发感染时，ALI/ARDS具有相当高的病死率[1,2]。潜在的机制是复杂的，知之甚少。目前认为SAP实际上是一种严重的全身炎症反应综合征（SIRS），炎性介质的失控性释放是造成SIRS的主要原因[3]。本实验探讨NF-κB在急性重症胰腺炎肺损伤发病中的作用及氯胺酮对其的干预效用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛磺胆酸钠购自Sigma公司，NF-κBp65mRNA 原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，氯胺酮由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，SD大鼠由湖南省人民医院实验动物中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

健康成年（10～12周龄）雄性SD大鼠60只，体质量180～250g。所有SD大鼠按随机数字表分为3组，A组：对照组；B组：SAP组；C组：氯胺酮干预组，每组20只。

1.2.2 SAP模型制备

术前所有SD大鼠术前禁食12h，自由饮水。麻醉采用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射。麻醉后仰卧位固定，术野备皮，消毒铺单。模型组上腹部正中切口，暴露十二指肠、胰胆管和胆总管，用小动脉夹夹闭靠近肝门的胰胆管，在手术显微镜下，将直径大约0.45mm的聚乙烯导管紧贴胰胆管汇入十二指肠处置人胰胆管，再用小动脉夹将远端也夹闭。用GRASBY 3500微量注射泵逆行泵入5%牛磺胆酸钠（1mL/kg，0.04mL/min），泵注完毕2～3min后即可见胰腺充血、水肿，胰胆管及主胰管扩张， 泵注完毕后保持压力10min后拆线，并退出导管，创面封闭胶封闭穿刺孔，撤除小动脉夹，将肠管还纳复位后关腹[4]。对照组为假手术组，开腹仅翻动胰腺后关腹。

1.2.3 氯胺酮干预实验

氯胺酮干预组术毕腹腔内注射氯胺酮4mg/kg（生理盐水稀释成1mL），对照组与SAP组手术后腹腔内注射生理盐水1mL。

1.2.4 肺湿干重比

每组10只于造膜12h后实验结束，放血处死，开胸取左肺组织称湿重（W）后将标本置于80℃电热干燥箱内烘烤48h，然后称干重（D），肺湿干重比=W/D。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞百分比与蛋白含量

处死动物前，夹闭左主支气管，经右支气管肺泡灌洗，回收率为90%，将肺泡灌洗液3000r/min离心10min，取上清液进行蛋白定量测定。取沉淀物用Giemsa染色后光学显微镜下计数白细胞和中性粒细胞，计算中性粒细胞百分比。

1.2.6 肺组织NF-κB p65Mrna

每组余下的10只SD大鼠中5只于术毕6h，另5只于术毕12h取右肺上叶组织用4%多聚甲醛、0.1%DEPC固定液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片。应用NF-κBp65mRNA原位杂交试剂盒检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠肺W/D、BALF中蛋白含量和中性粒细胞百分比的变化

对照组大鼠肺W/D为（4.52±0.28）；SAP组（6.42±0.25）与KTM组（5.58±0.19）的差异有统计学意义（P＜0.01）。SAP组大鼠BALF中蛋白含量和中性粒细胞百分比对照组明显升高（P＜0.01），KTM组与SAP组对比，BALF中蛋白含量和中性粒细胞百分比明显下降（P＜0.01），见表1。

表1 各组肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的变化（）

表1 各组肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的变化（）

与对照组相比，★P＜0.01；与SAP组相比，$P＜0.01

BALF中性粒百分比（%）对照组4.52±0.280.15±0.02822.56±8.45 SAP组6.42±0.25★0.68±0.045★78.85±9.680★KTM组5.58±0.19★$0.48±0.075★$56.72±10.63★$组别肺W/DBALF蛋白含量（ g/L）

2.2 肺组织中NF-κBp65mRNA的表达

NF-κBp65mRNA在对照组部分肺泡细胞细胞质内有表达，而在细胞核内未见表达。SAP组除肺泡细胞细胞质内有表达外，出现细胞核内表达。用图象分析仪测量细胞胞浆内阳性反应物的平均吸光度值（A），SAP组与对照组相比有显著性差异，（P＜0.01），KTM组与SAP组比较，NF-κBp65mRNA的表达明显降低（P＜0.01） （表2）。

表2 NF-κB p65mRNA在各组大鼠肺组织中的表达

3 结 论

已证实核转录因子-kappaB （NF-κB）在细胞内调控多种炎症介质转录过程中发挥了关键作用，并参与了SAP炎性介质的调控[5]。NF-κB通常以由NF-κB/Rel家族组成的同源或异源复合物形式存在，其中最常见的为p65/p50异二聚体，也是其活性的主要形式[6]。Kan[7]等研究发现NF-κB的激活可能是通过调节iNOS mRNA表达参与SAP肺损伤。Jaffray[8]等研究发现胰弹性蛋白酶诱导的细胞因子介导的肺损伤，这种途径是以NF-κB作为第二信使发挥作用。NF-κB的激活可促进多种炎性递质在SAP时过度表达，引起胰腺和胰外组织器官损伤。最近的数据表明氯胺酮有抗炎[9]作用。然而，氯胺酮诱导的免疫调节[10]机制则知之甚少。在这项研究中，我们采用牛磺胆酸钠制作大鼠急性坏死性胰腺炎模型，重点观察氯胺酮在肺损伤发生时对NF -κB的影响。研究氯胺酮的免疫调节作用是否与NF-κB有关。研究结果表明：SAP组大鼠BALF中蛋白含量和中性粒细胞百分比对照组明显升高，NF-κBp65mRNA在肺组织中的表达也明显增加，其表达亦随造模时间的延长而增强。说明SAP肺损伤与NF-κB的激活有关。KTM组与SAP组对比，肺湿干重百分比、肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒百分比均降低，可能是通过下调NF-κB p65mRNA的表达，减少炎症介质的产生有关。

总之，在这项研究中转录因子NF-κB表达的抑制可以解释一些与氯胺酮治疗相关的免疫抑制作用，如减少吞噬细胞表面受体和降低炎性细胞因子的生成等。但氯胺酮抑制NF-κB的信号途径需进一步阐明。此外，对于其他转录因子的影响还有待研究。

[1] Akbarshahi H,Rosendahl AH,Westergren-Thorsson G,et al.Acute lung injury in acute pancreatitis--awaiting the big leap[J].Respir Med,2012,106(9):1199-1210.

[2] Elder AS,Saccone GT,Dixon DL.Lung injury in acute pancreatitis: mechanisms underlying augmented secondary injury[J].Pancreato logy,2012,12(1):49-56.

[3] Ginis I,Jaiswal R,Klimanis D,et al.TNF - alpha-induced tolerance to ischemic injury involves differential control of NF - kappa B transactivation:the role of NF- kappa B association with p300 adaptor[J] J CerebBlood Flow Metab,2002,22(2):142.

[4] 王锋,黄鹤光,陆逢春,等.胆胰管结扎法制作大鼠胰源性肺损伤模型[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(1):26-30.

[5] 裴红红,杨正安,秦兆寅.核因子-κB与急性胰腺炎[J].中国危重病急救医学,2001,13(4):248-249.

[6] Ghosh S,May MJ,Kopp EB.NF-kappa B and Rel proteins:evolutionarily Conserved mediators of immune responses[J].Annu Rev Immunol,1998,16(2):225-260.

[7] Kan SH,Huang F,Tang J,et al.Role of intrapulmonary expression of inducible nitric oxide synthase gene and nuclear factor kappaB activation in severe pancreatitis-associated lung injury[J].Inflamm ation,2010,33(5):287-294.

[8] Jaffray C,Yang J,Carter G,et al.Pancreatic elastase activates pulmonary nuclear factor kappa B,mimicking pancreatitis-associated adult respiratory distress syndrome[J].Surgery,2000,128(2):225-231.

[9] Kawasaki T,Ogata M,Kawasaki C,et al.Ketamine suppresses proinflammatory cytokine production in human whole blood in vitro [J].Anesth Analg,1999,89(1999):665-669.

[10] Welters ID,Hafer G,Menzebach A,et al.Ketamine inhibits transcription factors activator protein 1 and nuclear factor-kappaB, interleukin-8 production,as well as CD11b and CD16 expression: studies in human leukocytes and leukocytic cell lines[J].Anesth Analg,2010,110(3):934-941.

R576

B

1671-8194（2013）24-0069-02