高压氧对弥漫性轴索损伤大鼠脑干水肿及AQP－4表达的影响＊

西安市第九医院神经外科（西安710054） 张西安 马康孝 刘展会 宋锦宁

弥漫性轴索损伤（DAI）是一种特殊类型的脑外伤，是指在头部遭受特殊钝性外力作用下由于剪应力的影响，脑内发生的广泛神经轴索变性、断裂、轴索回缩球形成为主要病理特征的改变［1］。神经轴索聚集区是DAI的好发部位，比如脑灰质白质交界区、胼胝体、脑干的桥脑基底部、小脑上脚等是神经纤维较集中的部位。创伤性脑水肿属于继发性脑损伤决定了脑外伤患者的预后。AQP－4在创伤性脑水肿的发生发展中起重要的作用［2］，参与了脑水肿的病理过程。DAI早期即出现脑干肿胀，此时脑干区含水量及AQP－4变化将产生相应的变化。研究发现高压氧（HBO）对脑外伤后脑水肿有促进其消退作用［3－4］。HBO治疗会对DAI大鼠脑干水肿有减轻作用，也将对脑干区AQP－4表达产生一定的作用。本实验通过使用HBO对DAI大鼠进行治疗，观察治疗后大鼠脑干区脑水肿及AQP－4的变化规律，初步探讨HBO的治疗机制。

材料与方法

1 材 料 健康雄性成年S－D大鼠110只，体重230～330g，110只大鼠共分为假损伤组（n＝10），DAI组（n＝50）及治疗组（n＝50），其中DAI组及治疗组按损伤后的时间又分为6h、1d、3d、5d及7d共5个亚组（n＝10，其中5只用于脑干含水量的测定，另外5只用于AQP－4免疫组化）。主要试剂及耗材：兔抗AQP－4抗体（北京博奥森公司），通用型SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Oly mpus BX－40光学显微镜（日本Ol y mpus公司），Leica－Q550CW图像采集与分析系统（德国Leica公司），高压氧舱 （烟台，GY－2200型）

2 实验方法 ①弥漫性轴索损伤大鼠模型的制作：采用刘晓斌等［5］研制的大鼠头颅瞬间侧向旋转装置，依据先前的实验结果，选择使用该装置带动大鼠头颅在冠状面旋转90°，制备大鼠DAI模型。先使用10%水合氯醛行腹腔麻醉大鼠，然后将其固定于旋转损伤装置上，在大鼠挣扎的间歇期扣下扳机，装置遂致大鼠头颅瞬间在冠状面旋转90°。而假损伤组，将麻醉的大鼠固定完毕后即从装置上卸下。②高压氧治疗：DAI模型制作成功1h后立即将DAI大鼠置入特制的有机玻璃箱中在箱顶设排气口，箱下方设供氧入口。将有机玻璃箱置于大型高压氧舱内，舱内温度、湿度按治疗常规设定，使用纯氧洗舱10 min后舱内氧气浓度升至95．0%以上，经过缓慢升压20 min，舱内压力升至0．2 MPa（2 ATA）后，稳定60 min，并持续给氧60 min，吸氧完成后匀速减压20 min至常压，每日治疗1次。③脑干含水量测定：将假损伤组、DAI组及DAI治疗组分别于伤后6h、1d、3d、5d、7d处死，开颅取全脑后再留取脑干部分，取材后以滤纸吸去脑干表面血迹和脑脊液，立即用电子分析天平称湿重。分析天平称湿重后置于80℃恒温干燥箱内干燥48～72 h至恒重后，称干重。按Elliot公式干－湿比重法计算脑含水量［6］：脑含水量＝（湿重－干重）/湿重×100%。④灌注及取材：在各个组预定时间点行腹腔麻醉后，左心室插管至升主动脉，依次使用生理盐水350 ml，再用4%多聚甲醛溶液250 ml灌注，完毕后开颅取脑并置于4%多聚甲醛溶液，4℃下浸泡固定24h。将固定好的脑组织取脑干上端修块，流水下冲洗，常规梯度酒精脱水，透明及浸蜡包埋。将蜡块连续冠状切片，片厚约5μm，每个脑块5张，表于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃恒温烤箱烘干用于AQP－4免疫组化染色。⑤免疫组化步骤：将脱蜡处理后的脑切片块置于0．01 M 柠檬酸盐中，经100℃下孵育15 min来进行抗原修复，然后3%过氧化氢溶液封闭，然后分别在用0．01 M PBS配制的兔抗AQP－4多克隆抗体（北京博奥森，1∶100）中孵育（1h，37℃），继而滴加生物素标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）孵育（30 min，37℃），切片使用SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）按操作说明孵育，DAB完成显色。苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，放入37℃恒温烤箱过夜后即可显微镜下观察。⑥免疫组化方法测定AQP－4的表达：采用免疫组化评分［7］的方法对 AQP－4蛋白表达进行半定量分析。Oly mpus BX－40光学显微镜（日本Oly mpus公司）下观察，每张切片观察5个连续40倍视野，具体方法如下：A为阳性细胞所占研究细胞整体的百分比（无表达，0；1～10%细胞表达，1；11～50%细胞表达，2；51～80%细胞表达，3；81～100%细胞表达，4）。B为所有阳性细胞评分总和（阴性计0分；弱阳性计1分；中阳性计2分；强阳性计3分）。A乘以B除以研究的总细胞数即为免疫组化评分结果。⑦ 图像采集与分析：Leica－Q550CW图像采集与分析系统采集免疫组化染色图像。每张免疫组化切片在预定范围内随机选择6个高倍视野（40×）进行免疫组化评分。

结 果

1 大鼠脑干含水量的测定 见表1。与假损伤组大鼠比较，DAI组大鼠损伤后6h脑干含水量较假损伤组明显升高（P＜0．05），至损伤后1d脑干含水量到达高峰，随后脑干含水量逐步下降，损伤后3d及5d脑干含水量仍显著高于假损伤组（P＜0．05），损伤后7d与假损伤组大鼠无明显差异（P＞0．05）。经高压氧治疗的损伤后6h，1d，3d和5d组大鼠脑干含水量与相应时间点DAI组比较均有明显降低（P＜0．05）。经高压氧治疗的损伤后7d组大鼠脑干含水量为与对应时间点的损伤组无明显差异（P＞0．05）。

表1 假损伤组、DAI组、治疗组大鼠脑干含水量的测定结果（）

表1 假损伤组、DAI组、治疗组大鼠脑干含水量的测定结果（）

注：与假损伤组比较＊P＜0．05；与同一时间点DAI组比较 △P＜0．05

组 别 6h 1d 3d 5d 7d DAI组 75．44±0．53* 77．62±0．81* 75．93±0．39* 74．67±0．54* 73．80±0．68治疗组 74．13±0．45△ 75．84±0．61△ 74．36±0．81△ 73．36±0．37△ 73．22±0．49假损伤组 72．48±0．39

2 免疫组化法测定AQP－4的表达 见表2。在光镜下AQP－4阳性细胞胞膜呈棕黄色深染，主要在大鼠脑干胶质细胞、毛细血管的内皮细胞及神经元细胞表达。假损伤组AQP－4蛋白微弱表达，只有少量阳性细胞。DAI后6h AQP－4免疫组化染色程度即较对照组有显著升高，在DAI后1d AQP－4免疫组化染色程度最强。随着损伤后时间的推移，AQP－4免疫组化染色程度逐渐减弱，DAI后3d及5d仍显著高于对照组。直至DAI后7d其免疫组化染色程度与对照组无明显差异（P＞0．05），表2、图1。另外，经高压氧治疗后，DAI大鼠脑干部位的AQP－4表达程度有不同程度的下降。6h、1d、3d、5d组免疫组化评分，与同时间点

DAI组比较具有统计学差异（P＜0．05），表2、图2。

表2 假损伤组、DAI组、HBO治疗组大鼠脑干AQP－4免疫组化评分结果（）

表2 假损伤组、DAI组、HBO治疗组大鼠脑干AQP－4免疫组化评分结果（）

注：与假损伤组比较＊P＜0．05；与同一时间点DAI组比较 △P＜0．05

组 别 6h 1d 3d 5d 7d DAI组 7．90±0．33＊* 9．72±0．61＊ 7．43±0．42＊ 7．31±0．53＊ 6．77±0．86治疗组 6．85±0．35△ 8．02±0．41△ 6．28±0．31△ 6．63±0．37△ 6．18±0．38假损伤组 6．31±0．43

图1 DAI组大鼠脑干AQP－4免疫组化（40×）

图2 治疗组大鼠脑干AQP－4免疫组化（40×）

讨 论

本实验使用刘晓斌［5］的大鼠DAI模型装置，该装置是在Si mt h［8］、贺晓生［9］的 DAI模型装置的基础上研制而成，采用瞬间旋转方式制成大鼠DAI模型。使用该装置建立的体外动物模型与其他DAI模型比较有以下特点：①损伤方式均一，受力过程可控制及量化，因而具有良好的可重复性。而Dixon等［10］的液压冲击模型及Mar marou［11］的打击负荷模型易并发明显的脑挫裂伤及蛛网膜下腔出血；②此种模型的颅脑损伤方式与交通事故中颅脑损伤的力学机制基本一致，复制出的动物模型具有明显的意识障碍这一重要临床特征。在贺晓生采用相似模型的研究中大鼠头颅旋转致DAI在病理变化上集中在脑干内。因此选择DAI大鼠脑干作为研究对象具有一定代表性。

AQP－4在中枢神经系统分布很广，是含量最高的水通道蛋白。通过免疫组化实验发现，AQP－4蛋白在星型胶质细胞和室管膜细胞内表达丰富，特别是在毛细血管内皮细胞及与软脑膜接触的胶质细胞膜，根据它的分布规律，推测它可能与水代谢和调节有很密切的关系［12］。Manley等［13］在急性水中毒脑水肿动物模型中发现，AQP－4在该模型的脑组织内表达增强；在缺血性脑水肿模型中，应用基因敲除技术使AQP－4在脑组织的表达缺乏，结果发现缺乏AQP－4的大鼠生存能力较野生型大鼠强，且脑内水的容量及星形细胞周围毛细血管水肿也明显减轻，说明AQP－4参与了脑水肿的形成，并在其中起重要作用。Kiening等［14］观察到压缩气体致大鼠脑冲击损伤24 h后脑水肿达高峰，而AQP－4 mRNA表达随时间延长而降低，在损伤半球降低更为显著，AQP－4 mRNA下调可减少水在星形胶质细胞内的进一步积聚。

在本实验中我们发现大鼠DAI后出现脑干区的损伤，表现为脑干含水量增加，在伤后6h开始出现脑干水肿，伤后第1d达水肿高峰，此后脑干水肿持续，但水肿程度逐渐减退，至伤后第5d仍高于假损伤组。同时脑干区AQ4表达在伤后也呈现先增高后减低的过程，高峰也出现在伤后第1天，此后渐减低，第5天AQP－4的表达仍高假损伤组。在多个脑水肿试验中，由于研究方法、手段、观测时间等的不同，关于AQP－4在外伤性脑水肿中的作用，结论并不一致。通过本实验可发现脑干水肿与AQP－4的表达有很强的相关性。

已有实验表明HBO通过使颈动脉系统收缩，使脑血流下降，这样便有效地降低了颅内压。有实验证明，0．2 MPa的HBO使脑血流减少21%，颅内压降低36%；0．3 MPa的HBO可使脑血流减少25%，颅内压降低40%［15］。所以HBO既能在脑血流减少的情况下，降低颅内压，又能改善供氧。

通过本实验将DAI组与HBO治疗组比较发现，各时间点治疗组脑干含水量均较DAI组明显减少，AQP－4的表达亦较DAI组明显减低。说明高压氧治疗对减轻脑干水肿有效。同时高压氧治疗能抑制AQP－4表达。因此，高压氧治疗脑外伤促进神经功能恢复的机制之一有可能是通过减少AQP－4蛋白表达来抑制脑干水肿的发生，从而减轻了继发性神经损伤，保护神经元结构稳定，维持神经元功能，并起到促进网状激活系统功能恢复，促进清醒的作用。对于高压氧治疗是通过何种分子机制抑制AQP－4的表达，进而减轻脑水肿还需要我们通过的进一步实验探索和发现。

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