糖心乐对糖尿病心肌病大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2表达的影响＊

安 荣 孔 维 赵莉平 丁 雯 丁延平 陕西中医学院（咸阳712046）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCMP）是一种特殊类型的心肌病。实验证明心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变中起关键作用［1］，Bcl－2家族成员在凋亡过程中扮演重要角色，其中Bnip－3起促进心肌细胞凋亡的作用、Bcl－2起抑制心肌细胞凋亡的作用［2］。中药复方糖心乐（TXL）是陕西中医学院王朝宏教授的经验方，按照中医辨证与西医辨病相结合的原则，运用现代中药药理研究成果，科学用药组方。本实验主要观察益气养阴、活血祛瘀TXL 对糖尿病心肌病大鼠心肌凋亡因子Bnip－3、Bcl－2的影响，初步探讨其可能作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 8周龄清洁级SD 大鼠80只，雌雄各半，体重170～200g，购于第四军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK（军）2012—006。饲养环境温度18～22℃，相对湿度60%～80%，定时通风，保持自然光照，动物每日喂普通饲料，自由饮水。

1.2 试剂与药物 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）为美国Sigma 公司产品，批号SL12136。葡萄糖（GLU）、胆固醇（CH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）测定试剂盒均购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；兔抗鼠Bnip－3、Bcl－2多克隆抗体（一抗）、即用型SABC 免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒，均为武汉博士德生物工程有限公司产品。中药复方糖心乐（TXL）制备：将绞股兰、人参、麦冬、田三七、生石膏等水煎3次，30min／次，将3次滤液收集蒸发为分别含生药1g／mL 和2g／mL 的汤剂。格列奇特（商品名达美康）：陕西东盛（集团）有限公司，80mg／片，批号：P2012121214203231。

1.3 仪 器 BS－800全自动生化分析仪、LKD－2188型超薄切片机、JEM－2000EX透射电子显微镜。

2 实验方法

2.1 DMCP动物模型建立与分组 首先随机各取雌雄SD 大鼠5只作为正常对照组，其余70只大鼠禁食12h后，每只用0.1mol／L 枸橼酸盐缓冲液（pH4.4）配制的0.55%STZ 以55mg／kg一次性腹腔注射，正常对照组腹腔内注射等体积枸橼酸盐缓冲液［3］。注射1周后采用眼外眦取血测空腹血糖，血糖大于13.8mmol／L为DM 造模成功者［4］，小于13.8mmol／L 共13只剔除。依据血糖高低排号，随机选取DM 造模成功大鼠雌雄各24只，随机分为模型对照组、达美康对照组、TXL 大、小剂量组雌雄各6只，饲养8周后形成DMCP大鼠［5］。在实验期间各组大鼠摄食普通饲料，正常饮水。

2.2 给药及方法 DMCP 大鼠形成后开始灌胃治疗。TXL大、小剂量组分别予以高浓度（2g／mL）TXL 汤剂14g／kg·d、低浓度（1g／mL）TXL汤剂7g／kg·d灌胃，达美康对照组予以浓度为3mg／mL 混悬液20mg／kg·d 灌胃，连续给药4周。正常对照组、模型对照组均予以生理盐水6.5g／kg·d灌胃。

2.3 指标测定 2.3.1 血生化指标测定：采用葡萄糖氧化酶法测定GLU，酶法测定CH、TG；直接一步法测定HDL、LDL。

2.3.2 电镜观察：在灌胃第4周末，动物用10%水合氯醛腹腔麻醉处死，迅速打开胸腔，取出心脏，用预冷的生理盐水充分洗净心脏血液，切取部分左心室前壁组织，经3%的戊二醛固定、常规PBS漂洗、丙酮梯度脱水、Epon812 包埋、超薄切片机切片、铅铀双重染色后透射电镜观察［5］。

2.3.3 免疫组化法测定Bnip－3、Bcl－2：左心室前壁组织剩余部分经常规石蜡包埋、切成4μm 切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的玻片备用。Bnip－3、Bcl－2抗体经高压热修复，采用免疫组化链霉菌抗生素蛋白－过氧化物酶（S－P）法，按试剂盒说明进行操作。光镜下以心肌细胞内出现黄色、棕色、棕褐色颗粒为Bnip－3、Bcl－2阳性表达。采用Image－Pro Plus分析软件进行图像分析，每张切片随机取5个视野测定阳性产物的积分光密度（IOD），取平局值代表表达强度，IOD 值越大，表示阳性表达越强。

3 实验结果

整个实验过程中大鼠共死亡5只，其中模型对照组2只雄性、1只雌性，TXL大、小剂量组各1 只雄性，达美康对照组和正常对照组均无大鼠死亡。死亡原因可能是血糖过高导致糖尿病酮症酸中毒、感染和其他糖尿病并发症。

3.1 TXL对DCMP大鼠血糖、血脂的影响 见表1。

表1 TXL对DCMP大鼠空腹血糖、血脂的影响（±s，mmol／L）

表1 TXL对DCMP大鼠空腹血糖、血脂的影响（±s，mmol／L）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与模型对照组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01；与达美康对照组比较，□P＜0.05，■P＜0.01

GLU CH TG HDL LDL正常对照组10 6.69±1.27 1.56±0.21 0.77±0.16 1.46±0.20 0组 别n .79±0.11模型对照组9 23.16±5.74▲2.83±0.57▲2.69±0.53▲0.81±0.22▲1.75±0.43▲达美康对照组12 10.54±2.06◆1.85±0.29◆1.11±0.23◆1.21±0.25◆1.04±0.26◆TXL大剂量组11 11.70±2.45◆2.03±0.25◆1.30±0.27◆1.18±0.21◆1.18±0.35◆TXL小剂量组11 16.34±2.92◆■2.44±0.54◇■1.84±0.44◆■1.04±0.23◇■1.31±0.33◇□

治疗4周后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血GLU、CH、TG、LDL水平均明显升高，HDL 水平明显下降，均有显著性差异（P＜0.01）；与模型对照组比较，达美康对照组、TXL大、小剂量组血GLU、CH、TG、LDL 水平均明显下降，HDL 水平明显升高，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；与达美康对照组比较，TXL 大剂量组血GLU、CH、TG、LDL 水平升高，HDL水平下降，均无显著性差异（P＞0.05），TXL 小剂量组血GLU、CH、TG、LDL 水平升高，HDL 水平下降，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。

3.2 TXL对DCMP大鼠心肌超微结构的影响 见图1～6。

正常对照组大鼠心肌肌丝排列整齐，明暗带清晰，无肌原纤维断裂、溶解，线粒体结构完整（图1）。DMCP模型对照组大鼠心肌肌丝排列紊乱，明暗带模糊，局部有肌丝断裂、溶解，线粒体肿胀、结构不清，肌纤维间出现大量糖原沉积，可见较多脂滴（图2），并可见鞘样结构（图3）。达美康对照组心肌超微结构与模型对照组比较，心肌结构明显改善，糖原、脂滴沉积减少（图4）。糖心乐大剂量组肌丝排列基本整齐，明暗带较清晰，线粒体结构较完整，糖原、脂滴沉积减少（图5）。糖心乐小剂量组肌丝仍有部分断裂，糖原、脂滴大量沉积（图6）。

3.3 TXL对DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影响 见表2。

表2 TXL对DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影响（±s）

表2 TXL对DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影响（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与模型对照组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01；与达美康组对照比较，□P＜0.05，■P＜0.01

组 别n Bnip－3Bcl－2正常对照组模型对照组达美康对照组TXL大剂量组TXL小剂量组10 9 12 11 11 69.37±4.63 95.13±6.11▲73.57±6.32◆77.13±7.93◆85.13±8.06◇■90.91±6.98 70.67±5.23▲88.07±6.79◆85.29±6.53◆79.98±7.06◆□

与正常对照组比较，模型对照组大鼠心肌Bnip－3表达水平均升高，Bcl－2表达水平下降，均有显著性差异（P＜0.01）；与模型对照组比较，达美康对照组、TXL 大、小剂量组心肌Bnip－3表达水平均下降，Bcl－2表达水平升高，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；与达美康对照组比较，TXL 大剂量组心肌Bnip－3表达水平均升高，Bcl－2表达水平下降，均无显著性差异（P＞0.05），TXL小剂量组心肌Bnip－3表达水平均下降，Bcl－2表达水平升高，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。

4 讨 论

糖尿病心肌病独立于血管、瓣膜损害所致心肌病，它是由糖尿病状态所致的一种心脏疾病，功能上定义为心室扩张，心肌细胞肥大，显著心肌间质纤维化，舒张功能障碍伴或不伴收缩功能障碍［6］。本实验用STZ作为糖尿病模型的诱导剂，选择大鼠作为造模动物是因其胰腺的B 细胞对STZ的敏感性较强而稳定［7］。给药1周后即可出现稳定高血糖状态，随病程8周进展为DCMP模型，经模型对照组检测血糖、血脂生化指标及心肌组织超微结构观察均符合DCMP，表明STZ腹腔注射法造模成功。

细胞凋亡是有机体由基因调控的细胞自主性死亡过程，又称细胞程序性死亡。而且细胞凋亡过程受多种基因调控，表现为凋亡信号通路的启动和相关基因产物的表达［8］。糖尿病从多个方面损害心肌细胞，研究证实心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病的重要发病机制之一。近年来，心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病的发生、发展中的作用已受到重视。目前认为Bcl－2家族是心肌细胞凋亡过程中非常重要的调节因子［9］，通过促、抑两类凋亡基因相互作用调节心肌细胞凋亡。Bcl－2家族蛋白根据其功能主要分为两大类：以Bcl－2、Bcl－xL 为代表的抑细胞凋亡因子；以Bnip－3、Bax等为代表的促细胞凋亡因子。其中Bcl－2的主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞存活时间。多数研究证实Bcl－2水平升高可抑制caspase活性，降低细胞色素C 释放，显著抑制细胞凋亡，该抑制可持续2周左右［10］。Bnip－3是近年来受到关注的Bcl－2家族中新的促细胞凋亡因子，可能通过上调氧化应激和线粒体呼吸相关基因，促进心肌脂肪酸氧化代谢及直接影响线粒体跨膜电势差等机制，介导高糖心肌细胞氧化应激。亦证明Bnip3参与糖尿病心肌广泛纤维化和心肌重塑的过程。加之Bnip3参与调控钙稳态和细胞炎症因子表达上调，提示其对糖尿病心肌病发病的各个环节中均有作用。有研究证实［11］，糖尿病大鼠心肌细胞凋亡增多与心肌促凋亡基因的过度表达以及抑制凋亡基因的下调有关。所以Bcl－2、Bnip－3是影响细胞凋亡的重要因素，是糖尿病心肌损害向糖尿病心肌病发展的重要节点蛋白，将作为治疗糖尿病心肌病的有效靶点之一。本实验结果可以看出，与正常对照组比较，模型对照组大鼠心肌Bcl－2表达明显减少，Bnip－3表达明显增多，说明高血糖可引起心肌细胞Bcl－2 基因表达下调，Bnip－3 基因表达上调。大量研究证实，高血糖能直接导致细胞凋亡，心肌细胞凋亡与高血糖引起的活性氧形成及局部肾素－血管紧张素系统（RAS）激活有关［12，13］。

中药复方TXL通过发挥中医药治疗的多层面、多向性、多靶点的药理特点，以多种途径降血糖，从而达到对抗高血糖所致促凋亡因子上调及抑凋亡因子下调，同时提高心肌细胞超氧化物歧化酶活性，清除自由基，而起到抗氧化作用，减少细胞凋亡。有研究证明达美康并不刺激活性氧生成，也能减少细胞凋亡。本实验结果看出，TXL 和达美康均能有效降低DCMP 大鼠心肌细胞促凋亡因子Bnip－3的表达，升高心肌细胞凋亡抑制因子Bcl－2的表达，而且TXL 作用与剂量有一定相关性，大剂量和达美康作用相当，证明TXL能通过影响Bcl－2、Bnip－3表达有效抑制DCMP大鼠心肌细胞凋亡，从而对心肌细胞起保护作用。

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