HPLC检测山茱萸中没食子酸和马钱苷的含量

杨 凌 朱 昱 王晓华 解放军第202医院药剂科（沈阳110812）

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fcinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，味酸、涩，性温，归肝、肾经。具有敛汗、涩精和补肝肾的功能，临床多用于治疗腰膝酸痛、阳萎遗精、小便频数、月经过多、体虚多汗等症［1］，是中医常用的滋补良药。据报道，山茱萸中的主要成分为多糖、酚类、有机酸、皂苷、环烯醚萜类、鞣质、挥发油、氨基酸和维生素A、B、C及微量元素等［2］。研究表明，马钱苷是山茱萸的主要活性成分之一，其主要药理作用多为抗炎和调节免疫［3，4］；体外实验证明，没食子酸具有抑制淋巴细胞转化和混合淋巴细胞反应的作用，浓度大于30μg／mL 可抑制98%，浓度大于15μg／mL可抑制70%［5］。常规研究多对单一成分进行分析，作为山茱萸药材的质量检测，为了更好的分析山茱萸的质量情况，本文采用波长切换HPLC 法同时检测山茱萸中的主要有效成分－马钱苷和没食子酸，该方法准确、高效、简便，具有较好的推广应用价值。

1 仪器与试药 Waters 600E 高效液相色谱仪（在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、Waters 2487VWD 检测器）；Mettler AG285电子天平（0.01mg）；KQ－500E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。山茱萸药材经鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。没食子酸对照品购于中国医药集团上海化学试剂公司；马钱苷对照品购于中国药品生物制品检定所。乙腈和甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备 称取山茱萸粉末约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，量取25mL加入70%甲醇，密塞，称定质量，超声提取40 min，再次称定质量，用甲醇补足丢失的质量，即得。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称定马钱苷和没食子酸对照品2.26mg 和2.27 mg，分别置10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容得混合对照品母液。再分别取该储备液适量，用70%甲醇逐级稀释成马钱苷浓度为l14、57、28.5、14.3、7.2、3.6 mg／L，没食子酸浓度为112、56.0、28.0、14.0、7.0、3.5mg／L的系列的混合对照品溶液，备用。

2.3 色谱条件 色谱柱：hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：A 为乙腈，B 为0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱法洗脱，具体洗脱程序见表1，分析时间为28 min；检测波长0－7 min：270nm，7.01～26min：240nm；柱温30℃；流速1mL／min；进样量10μL。理论塔板数按马钱苷计不低于2500。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 HPLC色谱图

2.4 检测波长的选择 分别取没食子酸对照品和马钱苷适量，用流动相稀释成10μg／mL，以流动相为空白，进行全波长扫描。

2.5 标准曲线的制定 精密吸取对照品混合液10μL进样测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得没食子酸回归方程为A＝3E＋07C－9205.7，r＝0.9999，线性范围3.5mg／L－112mg／L；马钱苷回归方程为A＝2E＋07C－6884.3，r＝0.9999，线性范围3.6mg／L－114mg／L。

2.6 方法学考察 2.6.1精密度试验：选取河南产地山茱萸，按“2.1供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，连续进样6次，分别计算峰面积，结果得马钱苷和没食子酸的精密度RSD 分别为1.3%、0.7%。

2.6.2 重复性试验：取河南产地山茱萸，按“2.1供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，平行制备5份，取10μL进样测定。具体结果见表2。

表2 重复性试验结果

2.6.3 稳定性试验：取河南产地山茱萸，按“2.1供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12h后进样测定，结果计算得马钱苷和没食子酸峰面积的RSD 分别为2.04%、1.27%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.6.4 加样回收率试验：称取山茱萸粉末1g，精密称定5 份，加入浓度为228 mg／L 马钱苷和226 mg／L没食子酸的混合对照品溶液0.8mL，按“2.1供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液并测定，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.7 样品含量测定 按2.1项下制备4批不同产地的山茱萸药材，按上述色谱检测条件检测，结果见表4。

表4 不同产地山茱萸中没食子酸和马钱苷的含量

3 讨 论 3.1 提取条件的考察 本实验分别选择了甲醇、70%甲醇、40%甲醇和95%乙醇，作为提取溶剂，超声30 min 比较提取效果，结果发现，以70%甲醇作提取溶剂，提取率较高。以70%甲醇为溶剂，考察提取时间和提取方法，分别超声提取30、40、50min，加热回流提取30、60、90min，结果发现超声提取率较高，且以超声40min为适。以70%甲醇为提取溶剂，提取方法采用超声提取40 min，考察提取溶剂加入量，分别加入10、25、40mL，结果表明提取溶剂为25mL时，提取率较高。通过上述实验，选择70%甲醇，25mL，超声40min为最佳提取条件。

3.2 色谱条件的考察 本实验考察了等度洗脱和梯度洗脱，结果发现等度洗脱分析时间长，分离效果差；同时考察了不同洗脱剂，确定以乙腈－0.1%磷酸为最佳洗脱溶剂。

3.3 总结 本实验采用HPLC 与波长切换法结合，同时测定山茱萸中的没食子酸和马钱苷成分。实验结果表明，本测试方法简便，准确，重现性好，可全方面考察山茱萸的质量，为山茱萸的质量控制和质量标准的研究提供具体的实验参考依据。同时，本文还测定了不同产地山茱萸中没食子酸及马钱苷的含量，发现北京山茱萸的没食子酸及马钱苷含量较高。不同产地的山茱萸质量不尽相同，因此，在药材选择时应将产地作为质量控制的主要影响因素。

［1］ 肖培根.新编中药志［M］.北京：化学工业出版社，2010：22.

［2］ 杨剑芳，路福平，高文远，等.山茱萸的化学、药理及开发应用研究进展［J］.现代生物医学进展，2006，6（12）：127－130.

［3］ 赵武述，张玉琴，李 洁，等.山茱萸成分的免疫活性研究［J］.中草药，1990，21（3）：17－20.

［4］ MARIA D CR.Structural Considerations on the Iridoids as Anti－inflammatory Agent［J］.Planta Med，1994，60：233－234.

［5］ 陈玉武，薛 智.制萸肉免疫活性成分的化学研究［J］中日友好医院学报，1992：6（增刊）：231.