白介素-13基因多态性与哮喘的相关性研究

濮海平，刘 华，吕振华，林荣军，傅翠捧，孙晓梅

支气管哮喘（简称哮喘）是全球最常见的慢性疾病，在许多地区近10～20年哮喘患病率增高了1倍[1]，并有逐年增高的趋势。哮喘为慢性气道炎症性疾病，长期的慢性炎症直接或间接引起气道重构，导致不可逆气流阻塞，严重影响患者的身心健康。IL-13是近年来新克隆的Th2型细胞因子，可通过募集、归巢、激活炎性细胞介导嗜酸粒细胞（EOS）的集聚和气道高反应性（ARH），而在哮喘的发生中起重要作用。IL-13可不依赖于其它Th2型细胞因子及嗜酸粒细胞IgE介导的途径而单独诱发哮喘的所有症状，是哮喘病理发生中的关键细胞因子，IL-13基因多态性与哮喘的易感性也密切相关。

尽管目前在哮喘的治疗方面已取得了巨大的进展，但由于哮喘发病率的明显增加，激素抵抗型哮喘的增多、支气管扩张剂和糖皮质激素的应用受到其局部和全身不良反应的限制。因此有必要探求治疗哮喘的新策略。由于IL-13在哮喘病理发生中的关键作用，因此IL-13是治疗哮喘的新目标。近年来，国外学者对IL-13基因多态性进行了深入的研究，发现IL-13基因多态性可能与哮喘间存在着密切的关系，但具体机制尚未完全明了。笔者对哮喘患者及正常对照组儿童IL-13 Intron3+1923位点C/T采用限制性内切酶片断长度多态位点法（RFL Ps）进行了基因多态性的研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 对象 哮喘组：在解放军401医院及青岛医学院附属医院就诊的汉族患者，符合以下条件者纳入试验：患者必须符合文献[2]的诊断标准，处于哮喘发作期，2周内未使用过糖皮质激素，无共患疾病，年龄 3～12 岁，平均（5.8±2.9）岁，共 96 例。 健康对照组：为同期健康查体的同龄汉族儿童，平均 （5.6±2.6）岁，均无哮喘病史，无家族及个人过敏史者共96名。以上受试者间均无血缘关系。

1.2 主要仪器、试剂及样本采集

1.2.1 主要仪器 水平/垂直板式电泳仪Bio-Rad（USA）；PCR 仪 Eppendorf（Germany）；水平/垂直板式电泳仪 Bio-Rad（USA）；酶标仪 ELX-800（USA）；紫外分光光度计Beckman DU-640（USA）。

1.2.2 主要试剂 EDTA-Na2（上海生工生物技术服务公司）；琼脂糖Promega；PCR Marker（华美公司）；Taq DNA 聚合酶 Promega；BsaA I限制性内切酶 N EB；IgE 试剂盒 （eliza）R＆D；IL-13 试剂盒（eliza）R＆D；引物合成（上海生工生物技术服务公司）。

1.2.3 样本采集 抽取所有受试者静脉血3 ml，2%乙二胺四乙酸二钠 （EDTA）抗凝，2 ml分离血浆-70℃冻存，1 ml用于取外周血白细胞基因组 （要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2 h，4℃放置不超过5 h，以防白细胞自溶）。

1.2.4 基因组提取 采用NaI提取法提取外周血白细胞。取外周抗凝血 （全血）100μl于Ep管中，12 000 r/min离心12 min，弃上清，加双蒸水200 μl溶解，摇匀 20 s，混匀后加 6M NaI溶液 200 μl，摇匀 20 s，加氯仿/异戊醇（24∶1）400 μl，即加即摇，摇匀 20 s，12 000 r/min 离心 12 min。 取上层液 350 μl，加入另一新Ep管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20 s，室温放置15 min，静置后的反应体系15 000 r/min离心12 min，使沉淀紧贴Ep管壁。弃异丙醇，加 70%乙醇溶液1 ml（不振动），15 000 r/min离心12 min。弃乙醇，敞开Ep管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加 1×TE 溶液 30 μl，溶解 DNA＞12 h 以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

1.3 方法

1.3.1 血浆IL-13、TIgE的测定 均采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测，严格按说明书操作。

1.3.2 IL-13+1923引物设计 引物序列参考文献[3]：上游引物 5‘-GGACAGGGA CCCACTTCACAC-3’，下游引物 5‘-GCTAACATATTTAATATTTATGT AC-3’。

1.3.3 聚合酶链反应 该反应在PCR仪上进行，总反应体积为 25 μl，80 ng 基因组 DNA，10 mmol/L Tris-HCL （pH8.3），50 mmol/L KCL，1.5 mmol/L MgCl2， 200 μmol/L dNTP， 上下游引物各 50 ng，1.5UTagDNA聚合酶。反应过程：94℃变性2 min，然后 94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，共 33个循环；然后72℃延伸10 min。

1.3.4 IL-13+1923限制性片段长度多态性检测取上述PCR产物10 μl加 BsaA I 5U，37℃酶切过夜，然后在3%琼脂糖凝胶上加溴化乙锭（终浓度为0.7 μg/ml），取 8 μl酶切产物在凝胶上上样电泳，以PCR Markers作为DNA片段的标准参照物，紫外灯照射下观察拍照。IL-13+1923位点基因型为：TT基因型出现559 bp 1条带；CC基因型出现310、249 bp 2条带；杂合子TC基因型出现559、310、249 bp 3条带。

1.4 统计学分析 用基因计数法分别统计哮喘组和对照组基因型和等位基因分布频率，数据经Hardy-Weinberg平衡检验后，用SPSS10.0计算机统计软件分析，两组之间的基因型和等位基因分布频率显著性分析用χ2检验，两组间IL-13、IgE浓度显著性分析用t检验，不同基因型间血浆总IgE浓度比较用方差分析。

2 结 果

2.1 IL-13基因+1923位点多态性分析 +1923位点PCR/RFLP结果见图1。TC基因型：酶切产物为 559、310、249 bp；CC 基因型酶切产物为 310、249 bp；TT基因型为 559 bp。

图 1 IL-13+1923位点不同基因型PCR产物经BsaA I酶切分型

2.2 哮喘组与对照组+1923位点基因型频率和等位基因频率分布比较 按文献[4]对哮喘组和对照组的IL-13基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，吻合度测验结果表明，该位点的基因型期望值和观察值之间无统计学差异（哮喘组χ2=0.29，P>0.05； 对 照 组 χ2=0.06，P>0.05）， 符 合 Hardy-Weinberg遗传平衡。这说明所取样本资料具有代表性、可靠。基因型频率分布：哮喘组与对照组比较有显著性差异（χ2=9.85，P＜0.01），不同的基因型哮喘的患病率，变异等位基因T携带者（TT及CT基因型）患哮喘的危险性高于非携带者 （CC基因型）；等位基因频率分布：两组之间亦有显著性差异（χ2=9.27，P＜0.01）。 见表 1。

2.3 IL-13＋1923位点不同基因型对血浆IL-13及TlgE水平的影响 哮喘组中TT、TC基因型人群IL-13及TlgE水平与同组及对照组CC基因比较均有显著性差异（P<0.01），见表 2。

3 讨 论

哮喘是一种以EOS浸润为主的气道反应性炎症和以AHR为特征的疾病，发病机制尚未完全阐明。目前认为，气道炎症是哮喘AHR的基础，而EOS是其关键的效应细胞[4]。EOS在哮喘气道的聚集是哮喘发作的一个中间环节，EOS的浸润是气道病理的主要特征。IgE是引起哮喘的主要效应分子，IgE结合许多效应细胞（如肥大细胞，嗜碱性粒细胞等）表面的受体，引起效应细胞释放炎性介质，导致气道高反应性，增强黏液分泌和静脉通透性。IL-13作为Th2型细胞因子，可通过EOS炎症细胞聚集间接诱导AHR，还可直接诱导AHR。近年来研究表明，IL-13在诱导B细胞分泌IgE中也起重要作用，是体内仅有的2种可以直接促进IgE合成的细胞因子之一。IL-13诱导EOS在支气管黏膜层募集，延长嗜酸性粒细胞的的寿命，抑制其凋亡，表明IL-13在哮喘的发生中起到极其重要的作用[5-7]。笔者通过对哮喘患者及正常对照组儿童IL-13 Intron3+1923位点C/T采用限制性内切酶片断长度多态位点法（RFL Ps）进行基因多态性的研究，结果显示，+1923位点三种基因型CC、CT和TT及等位基因C、T的频率分布在所研究的两组人群中均存在显著性差异，且T等位基因携带者患哮喘危险性较非携带者高约2倍，这说明等位基因T与哮喘关联，携带T等位基因的个体具有哮喘易感性。本文结果还显示：在哮喘或对照组，血浆IgE水平在CC、CT及TT基因型间依次增高，该结果与这三种基因型个体患哮喘的危险性依次增高是一致的，且具有相同基因型的个体，哮喘患者的IgE水平高于对照组。这也提示IgE在哮喘发病中的作用。笔者认为，+1923位点不同基因型个体患哮喘的危险性不同与该位点不同等位基因所引起的生物学改变是有一定联系的。本文结果显示，血浆IL-13水平与IL-13+1923位点C/T基因多态性有关，当IL-13+1923位点为胞嘧啶（C）时，血浆IL-13水平较低，说明IL-13 mRNA表达较少；而当IL-13+1923位点为胸腺嘧啶（T）时，血清IL-13水平较高，说明IL-13 mRNA表达较多。这一结果提示IL-13+1923位点基因多态性与血清IL-13间存在着密切的关系。

IL-13 Intron3+1923位点基因多态性影响IL-13 mRNA表达，可能的机制为：①当IL-13 Intron3+1923位点为胞嘧啶（C）时，甲基化DNA可直接干扰转录因子与其结合，阻碍转录进行，而当发生C→T突变时，这种干扰作用消失，转录速度将加快，IL-13 mRNA增加，且IL-13 mRNA表达量将增加[8]；②5-甲基胞嘧啶能与特异性甲基化DNA蛋白结合，从而阻断或取代转录因子的作用，转录速度下降；如果5-甲基胞嘧啶脱氨基形成胸腺嘧啶（T）时，则这种阻断作用消失，因而转录速度将加快；③内含子是高等真核生物基因中主要的非编码元件，以往曾被认为无重要的功能，但近年来研究表明，它在RNA剪切过程中可能有重要的作用。RNA剪切过程就是精确去除内含子，而内含子碱基发生位点突变后，可能造成内含子剪切异常，并可能导致基因重组、外显子重复或者外显子再现而提高了特异功能结构域的剂量，这样可能提高蛋白质的活性或使翻译后剪切产生多个功能单位而引起剂量效应[8]。当然IL-13 Intron3+1923位点基因多态性对转录及翻译水平影响的确切机制尚未完全明了，这有待国内外专家在基因分子水平上做更深入的研究。

表 1 IL-13+1923位点哮喘组与对照组等位基因频率分布

表 2 IL-13+1923位点哮喘组与对照组不同基因型血浆IL-13及总IgE水平（x±s）

目前认为哮喘是一种多基因遗传病，同时受遗传因素和环境因素的双重影响。因此，对哮喘的治疗，至今还没有一种很好的方法。随着分子生物学和分子遗传学的发展，对哮喘基因的研究使人们能在基因水平上对哮喘进行治疗。应用抗IL-13抗体，以阻断IL-13的作用，或通过蛋白酶信号转导通路干预IL-13的合成，以及应用反义寡核苷酸抑制受体的表达也将可能成为特异性治疗哮喘的新的途径。

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