凝胶净化液相色谱法同时检测高油脂食品中黄色2G、奶油黄和柑橘红2色素

奚星林，王 岚，余书奇，徐 娟，邵仕萍，潘丙珍，邹志飞

(1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州 510623;2.暨南大学，广东广州 510623)

合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、色调多、成本低的特点，故为生产厂家广泛使用。合成色素是以苯、甲苯、奈等化工产品为原料，经过一系列有机反应而制成，合成色素因混有中间产物而具有一定毒性。毒理学及临床医学的发展证明，某些合成色素有慢性毒性或致癌性。2004年广东和香港等地水果市场相继发现“染色橙”，含禁用及可能致癌的柑桔红2号色素。过去用于人造奶油着色的奶油黄，早已被证实可以导致人和动物患上肝癌，而其它种类的合成色素如橙黄能导致皮下肉瘤、肝癌、肠癌和恶性淋巴癌等。各国对人工合成色素在食品中允许使用的品种、范围和添加量作了严格的规定，我国GB/T 2760－2011《食品添加剂使用卫生标准》明确规定食品中添加食用色素的范围和用量，在我国黄色2G、奶油黄和柑橘红2是不允许使用的。色素的测定常用液相色谱法［1－8］，黄色 2G、奶油黄和柑橘红 2都是油溶性色素(结构式见图1)，检测柑橘红2有高效液相色谱法［9］，但目前未查到食品中黄色2G、奶油黄的检测方法，也没有和柑橘红2同时检测的文献报道。本文首次报道用环己烷－乙酸乙酯提取高油脂样品中的色素，用凝胶净化柱净化，反相高效液相色谱检测食品中黄色2G、奶油黄和柑橘红2，并用质谱定性。

图1 黄色2G、柑橘红2号和奶油黄的结构图Fig.1 Structure of yellow 2G，butter yellow and citrus red 2

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄色2G(纯度98%)、奶油黄(纯度98%)和柑橘红2(纯度90%) 均购自Sigma公司，甲醇、环已烷、乙酸乙酯为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪(waters 2695型，配备二极管阵列检测器)、凝胶渗透色谱仪(美国J2 Scientific GPC)美国。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取 辣椒油、香肠等样品粉碎混匀后，称取样品2.000g于50mL离心管中，加入环已烷－乙酸乙酯提取液10mL，于旋涡混合器涡旋1min后，超声萃取 15min，再置于离心机中 4000r/min离心10min，吸取上清液，残渣再加提取液10mL提取，超声、离心，合并两次提取液，旋转蒸发至10mL，待净化。辣椒油等油状样品称取样品1.00g，加10mL提取液溶解，待净化。

1.2.2 样品净化 将凝胶柱床液面放至胶床表面后，用环已烷－乙酸乙酯把1.2.1中的提取液转移到凝胶柱上层，待液面降至柱床表面后，再加入淋洗液洗脱。弃去前洗脱液50mL，再收集洗脱液25mL，将所得洗脱液于氮吹仪上吹干，残渣用甲醇1.0mL溶解，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。

1.2.3 仪器及条件 色谱柱:Ultimate C18柱(5μm，4.6mm ×250mm);流速:1.0mL/min;柱温:30℃;检测波长:350、410、514nm;进样量:10μL。流动相:甲醇(A)+水，甲醇初始比例为80%。20分钟升至100%，2min后恢复到80%。

凝胶色谱净化条件:凝胶净化柱:Bio－Beads，S－X3，300mm ×25(内径)mm;38～75μm。流动相:环己烷－乙酸乙酯(1+1，体积比，以下同)。流速:4.7mL/min。进样量:5mL。

1.2.4 标准溶液的配制和曲线绘制 标准储备溶液:准确称取黄色2G、奶油黄和柑橘红2标准品(10±0.1)mg，置于100mL容量瓶中，用少量甲醇液溶解，并用甲醇定容至刻度，混匀，该溶液浓度为100μg/mL。

标准工作溶液:根据需要移取适量标准储备液，用甲醇稀释配制 0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L 系列工作溶液。按照上述色谱条件进行HPLC测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

1.2.5 样品分析 在相同的色谱条件下，分别将标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。以待测物色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。同时以二极管阵列检测器的光谱图进行定性分析。

2 结果与讨论

2.1 凝胶层析柱洗脱规律的探索

凝胶渗透净化是利用空间排阻(分子尺寸大小)进行分离，能够有效去除油脂、天然色素等高分子量的干扰物。取10mL 1μg/mL标准品溶液过凝胶渗透色谱，分为四段收集，每段六分钟，分别收集第2(回收率1)、第3(回收率2)和第4(回收率3)段的溶液，旋转蒸发至干，用甲醇定容为1mL，上液相，结果如表1。

表1 凝胶渗透净化后3种色素标准溶液回收率(%)Table1 The recovery of 3 color standard solutions after GPC purification(%)

逐步调整分段时间，发现当每段时间分别为11、10、3min，收集第2段溶液时回收率最理想，黄色2G、奶油黄和柑橘红2号的回收率分别达到98.0%、99.5%、99.0%。

注意，定容应用甲醇，3种待测色素在己腈中会有析出，影响检测结果。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长的选择 黄色2G、奶油黄和柑橘红2色谱峰的吸收波长分别为350、410，和514nm。选择410nm为奶油黄检测波长，350nm为黄色2G检测波长。514nm为柑橘红2检测波长。

2.2.2 流动相的选择 固定检测波长，分别考察甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙酸铵溶液、乙腈－乙酸铵溶液等流动相系统对于待测物的色谱峰形的影响。

结果表明，以水和0.02mol/L乙酸铵溶液流动相，两者没有明显区别，以甲醇－水更为简便。随着甲醇比例的增加，洗脱能力逐渐增强，兼顾到合适的保留时间和良好的色谱峰形，最终选择甲醇初始比例为 80%。20min升至 100%，2min后恢复到80%。

2.2.3 柱温的选择 在检测波长和流动相固定以后，对不同的柱温(25～40℃)进行考察。结果表明，当柱温为30℃时，待测物的保留时间和色谱峰形最为理想。

2.3 工作曲线及方法的定量限

根据本方法所确定的实验条件，取0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L系列工作溶液注入色谱仪中。以待测物色谱峰的峰面积为纵坐标对相应色素浓度(X轴)作图，结果表明，待测物浓度在1.0～10.0mg/L范围内，待测物的线性方程和线性相关系数见表2。浓度与其对应的峰面积值呈良好线性关系。当样品中的待测物超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。按信噪比为3计算方法的检出限(以样品计)，按信噪比为10计算方法的定量限(以样品计)。

表2 线性方程和线性相关系数Table2 Linear equation and correlation coefficient

图2 黄色2G、奶油黄和柑橘红2标准品色谱图(5mg/L)Fig.2 HPLC chromatograms of mixed color standard solutions(5mg/L)

2.4 方法的抗干扰能力

在空白(即未检测待测色素)辣椒油样品中加入黄色2G、奶油黄、柑橘红2、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ甲醇溶液，使之浓度为10.0mg/L。按1.2方法处理后上机测定，分离效果见图2，结果表明，黄色2G、奶油黄和柑橘红2的回收率分别达到87.6%、98.5%、82.9%，苏丹红Ⅰ～Ⅳ在此条件下虽被提取，在色谱图上也出峰，但其保留时间与黄色2G、奶油黄和柑橘红2完全分离，不影响黄色2G、奶油黄和柑橘红2的测定。

图2 空白样品中加标的待测3种色素与苏丹红Ⅰ～Ⅳ色素分离色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed colors and sudan redⅠ～Ⅳ in blank sample

2.5 试样回收实验

选用基质复杂的香肠和辣椒油样品做回收率实验，设置3个添加浓度，每个添加浓度进行6次实验。回收率结果见表3、表4。

表3 香肠中黄色2G、奶油黄和柑橘红2回收率和精密度实验结果(n=6)Table3 Recoveries of the mixed colors fortified to sausage(n=6)

表4 辣椒油中黄色2G、奶油黄和柑橘红2回收率和精密度实验结果(n=6)Table4 Recoveries of the mixed colors fortified to chili oil(n=6)

2.6 样品检测

对市售12个火腿肠、香肠、辣椒油、腊肉样品进行检测，未检出黄色2G、奶油黄、柑橘红2和苏丹红Ⅰ～Ⅳ色素。

3 结论

本文首次利用凝胶色谱法净化液相色谱法检测高油脂食品中黄色2G、奶油黄和柑橘红2色素。凝胶色谱法在去除油脂和天然色素方面效果良好，该方法具有简便、抗干扰、准确、重现性好等特点，可以满足实际检测工作的需要。

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