金属离子对桑黄菌丝体及胞外多糖含量的影响

高慧娟，刘雨晴，李娟辉，董瑞丽，王晓琴，贺旭阳，张万恒，张芬琴，*

（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.攀枝花市产品质量监督检验所，四川 攀枝花 617000）

桑黄是一类具有重要药用价值的大型真菌，现代研究表明，桑黄多糖具有良好的抗癌和保肝护肝活性，并且无毒副作用，具有较高的经济价值。在我国，天然桑黄数量非常稀少，而桑黄菌的人工栽培尚处于起步阶段，采用液体培养获得具有药理活性的菌丝体和胞外多糖，便于工业化生产[1]。研究结果表明，桑黄菌丝体的成分类似于子实体的活性成分[2]，蛋白质含量和还原糖含量，分别是子实体中蛋白质和还原糖含量的4 倍多，粗脂肪含量是子实体中含量的2 倍，脂肪酸含量和子实体中相当，氨基酸总量较子实体中高，种类丰富，还含有黄酮类物质和酚类物质，与野生子实体相比，具有较高的营养价值和开发价值[3]。

金属元素对微生物的生长繁殖和正常代谢不可或缺[4]。研究不同金属离子对桑黄菌丝体生长速度的影响，不仅可以确定有利于桑黄菌丝体生长的金属离子，同时也可以提高菌丝体中金属离子含量，为人体补充相应金属离子，增加其药用价值。目前，对于金属离子对桑黄生长的影响的研究较少，本文通过平板培养和液体发酵，研究不同金属离子对桑黄菌丝体生长速度、菌丝体干重、胞外多糖的含量的影响，为今后进一步开发利用桑黄提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑黄菌种：由河西学院农业与生物技术学院微生物实验室提供；PDA 培养基马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2 %，水1 000 mL，pH 自然。KCl、NaCl，CaSO4，MgSO4，FeSO4，ZnSO4，MnSO4，CuSO4为国产分析纯。

BT8025B2H 型恒温振荡培养箱：深圳永业昌机电有限公司；MJX-160 型恒温培养箱：宁波江南仪器厂；CL-32L 型高压灭菌锅：ALP 公司；5A2003 型精密电子天平：良平仪器；TQHZ-2002A 型台式恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；BDC-188 型冰箱：博西华家用电器有限公司；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大量金属元素对菌丝体生长的影响

在基础培养基中分别加入1.1 中所列的大量金属元素，分别设不同的浓度（1、3、5、7 mg/mL 和9 mg/mL），每种浓度设3 次重复，以基础培养基中不加任何金属离子作对照。试验采用随机区组设计，将培养基在121 ℃下灭菌30 min 后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培养基冷却后，取直径为6 mm 桑黄菌落一块，置于平板中央，放在28 ℃恒温箱内培养9 d，用十字交叉法测定菌落直径，求出生长速度（mm/d），记载菌丝生长势（长势浓密用“+++”表示，较浓密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生长用“-”表示），以及菌落颜色和形状[5]。

1.2.2 微量金属元素对菌丝体生长的影响

将1.1 中所列的微量金属元素分别加入基础培养基中，使培养基含有不同微量元素，并将同一微量元素在培养基中的含量配制成不同的浓度（0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL 和0.9 mg/mL），每种浓度设三次重复，试验采用随机区组设计将培养基在121 ℃下灭菌30 min后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培养基冷却后，取直径为6 mm 桑黄菌落一块，置于平板中央，放在28 ℃恒温箱内培养9 d，用十字交叉法测定菌落直径，求出生长速度（mm/d），记载菌丝生长势（长势浓密用“+++”表示，较浓密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生长用“-”表示），以及菌落颜色和形状[5]。

1.2.3 菌丝体干重的测定

取三块6 mm 直径大小的桑黄菌丝体，加入含有金属离子的PDA 培养基中，同一金属离子浓度重复三次，置于28 ℃恒温振荡器中培养，转速为130 r/min。培养7 d 后取出，纱布过滤后，用自来水冲洗三次，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，即为菌丝体干重[6]。

1.2.4 胞外粗多糖含量测定

取发酵液5 mL，加入10 mL 的乙醇，放入冰箱醇析过夜，得乳白色絮状沉淀，然后用事先烘干称重的滤纸过滤，再将含滤渣的滤纸放入60 ℃烘箱内烘干至恒重，则得到发酵液中粗多糖的含量[7]。

2 结果与分析

2.1 大量金属元素对桑黄菌丝体生长的影响

大量金属元素对桑黄菌丝体生长的影响，见表1。

表1 大量金属元素对桑黄菌丝体生长的影响Table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

续表1 大量金属元素对桑黄菌丝体生长的影响Continue table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

由表1 中的结果表明：在分别含有3、5、7 mg/mL的Ca2+和1、3 mg/mL Mg2+的培养基上，桑黄菌丝体生长浓密、且菌丝生长速度显著高于对照组；而分别在7 mg/mL 和9 mg/mL 的K+和Na+的培养基上菌丝体生长受到显著的抑制作用，菌丝体颜色呈现浅黄色，菌丝体较稀疏，且菌丝生长速度显著低于对照；分别含有1、3 mg/mL 的Na+，1 mg/mL K+，5 mg/mL Mg2+和9 mg/mL Ca2+的培养基上菌丝体生长速度较对照高，但是影响差异不显著；而在3 mg/mL K+，7、3 mg/mL Mg2+和1 mg/mL Ca2+的培养基上，菌丝体生长速度较对照低，影响差异不显著，结果见表1。说明较高浓度的Ca2+和Mg2+对桑黄菌丝体生长和胞外多糖分泌具有明显的促进作用，而高浓度的K+和Na+对桑黄菌丝体生长具有明显的抑制作用。

2.2 微量金属元素对桑黄菌丝体生长的影响

微量元素对桑黄菌丝生长的影响，见表2。

表2 微量元素对桑黄菌丝生长的影响Table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

续表2 微量元素对桑黄菌丝生长的影响Continue table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

从表2 中可以看到：在分别含有0.5 mg/mL 和0.7 mg/mL 的Fe2+和0.1 mg/mL Cu2+的培养基上，桑黄菌丝体生长浓密、且菌丝生长速度显著高于对照组；而在浓度高于0.1 mg/mL Cu2+，0.9 mg/mL Fe+，0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Mn2+的培养基上的菌丝体生长受到显著的抑制作用，菌丝体颜色呈现浅黄色，菌丝体稀疏；在0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Zn2+，0.1、0.3 mg/mL Fe2+，的培养基上，桑黄菌丝体生长速度较对照低，但影响差异不显著；在0.1 mg/mL Mn2+和0.1 mg/mL Zn2+培养基上，桑黄菌丝体生长速度较对照高，但影响差异不显著。

2.3 金属离子对桑黄菌丝体干重及胞外多糖含量的影响

对促进桑黄菌丝体生长的各种金属离子加入到PDA 液体培养基中，桑黄菌丝体和胞外多糖含量见表3。

表3 金属离子对桑黄菌丝体干重及胞外多糖含量的影响Table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

续表3 金属离子对桑黄菌丝体干重及胞外多糖含量的影响Continue table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

从表3 中可以看到，3、5 mg/mL 和7 mg/mL Ca2+的液体发酵培养基中菌丝体干重极显著高于对照组，较空白对照菌丝体干重高出，1 mg/mL 和3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+以及0.7 mg/mL Fe2+的液体发酵培养基中菌丝体干重显著高于对照组；0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和0.7 mg/mL Fe2+的液体发酵培养基中胞外粗多糖的分泌显著高于对照组。

2.4 结果讨论

微生物在生长及其次级代谢过程各种金属元素如钾、钠、镁、锰、铜、铁、锌、钙等起着极其重要的作用。钙是微生物重要的阳离子，是蛋白酶的激活剂[8]；镁在糖酵解、呼吸、氧化磷酸化等过程中起重要作用，是各种激酶，柠檬酸裂合酶和碱性磷酸酶等的辅助因子，是多种酶的激活剂，同时镁对重金属如钴和镍的毒性有拮抗作用；铁是细胞色素和铁氧化还原蛋白的氧化还原反应中必不可少的电子载体，在电子传递体系中起至关重要的作用；锌是各种金属蛋白酶、碳酸酶、醇脱氢酶等的辅助因子[9]。金属离子是微生物生长繁殖不可或缺的营养要素，也是微生物正常代谢必不可少的一类营养物质[4]。在C/N 一定的条件下，培养基中的金属离子对细胞生长有着重要的影响[10]。适量的金属离子可以对真菌的生长，次级代谢产物的生产具有明显的作用[11]。

金属离子对桑黄菌丝体生长和胞外多糖分泌也有重要影响，Ca2+，Na+，Mg2+和Fe2+对菌丝体生长具有明显的促进作用，菌丝体干重明显高于对照组，Na+，Zn2+，K+，和Fe2+对桑黄胞外多糖的分泌具有促进作用，而Fe2+，Mg2+，Ca2+在较大浓度时促进桑黄菌的生长。桑黄菌对金属离子尤其是Cu2+、Mn2+、Zn2+等微量金属离子的需要量极少，这些离子在较低浓度时能刺激生长与代谢，对桑黄菌的生长有促进作用，高浓度有抑制作用因为它们会和必要的其他技术竞争含硫化合物和氧的结合位点，破坏核酸和蛋白质的结构，干扰氧化磷酸化和渗透压平衡。另外，培养基中加入金属盐离子，会引起细胞渗透压的变化，从而影响真菌的生长，高浓度的重金属可以抑制微生物的生长和繁殖、阻遏呼吸作用、使细胞形态异常甚至使细胞裂解、改变核酸和蛋白质的结构、干扰氧化磷酸化、影响细胞渗透压平衡、重金属胁迫培养对微生物生长的影响[12]。

3 结论

1）不同浓度的大量金属元素对桑黄菌丝体生长速度的影响不同，3、5mg/mL 和7mg/mL 的Ca2+和1mg/mL 和3mg/mLMg2+促进菌丝体生长；在7mg/mL 和9 mg/mL 的K+，7 mg/mL 和9 mg/mL Na+抑制菌丝体生长。

2）在液体摇瓶发酵中，3、5、7 mg/mL Ca2+，1、3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+和0.7 mg/mL Fe2+的培养基促进菌丝体干重量的积累，是空白菌丝体干重量的5 倍～8 倍；而0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5、0.7 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和的培养基促进胞外粗多糖的分泌，3 mg/mLNa+中胞外多糖含量高达0.7105g/100mL。

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