响应曲面法优化红菜苔多酚提取工艺的研究

杨红，操德群，朱江，谢顺岚，李建华

（特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感 432000）

红菜苔（Brassica.campestris L.var.purpurea Baileysh）红菜苔又名芸菜苔、紫菜苔等，是十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的一个变种，广泛种植于我国南方地区，因湖北武汉市洪山区所产的红菜苔久负盛名，因此产自该地的红菜苔又名“洪山菜苔”；红菜苔外皮及叶脉均呈紫红色，茎肉浅绿色；该蔬菜不仅适应性强、产量高，其且营养全面，含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、和人体必需的微量元素等[1]，在唐代曾被封为“金殿玉菜”。

植物多酚（plant polyphenol）又名植物单宁（vegetable tannin），是一类广泛存在于植物体内的复杂酚类次生代谢物质，包括原花青素类、黄酮醇类、酚酸类、儿茶素类、花青素类和二羟查耳酮类等，主要存在于植物的皮、木、叶、根、果实等部位[2-4]。根据来源的不同，植物多酚亦被称为如茶多酚[5]、葡多酚[6]、苹果多酚[2]等。植物多酚具有抗氧化、抑制酶活性、抑菌、抗致突变、消炎、降血压等多种生物活性[7]。

由于红菜苔的叶子和茎皮的适口性不佳，许多人在食用时会剥去茎皮，并将其叶子几乎全丢掉，只留顶尖的花和嫩叶，这样就会产生很多的茎皮和叶子。由于红菜苔的茎皮和叶片中富含植物多酚，采用适当的工艺，提取红菜苔茎皮和叶片中的多酚，对于充分开发利用红菜苔，具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 原料试剂与仪器

1.1.1 原料

新鲜红菜苔，产自湖北省孝感市。

1.1.2 试剂

没食子酸、Folin-Ciocalteau 试剂、蒸馏水、乙醇、碳酸钠溶液。

1.1.3 仪器

752 N 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；康丽SO200-A 多功能搅拌机：顺德市宝锋电器厂；检测检验筛：浙江上虞市龙翔精密仪器厂；SHZ-ⅡD 型循环水真空泵：上海来荣生化仪器厂；202-2 型干燥箱：上海市实验仪器总厂；PL203 型电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

用Design-Expert 软件中的中心组合设计（Central Composite Design，CCD）模块中的二次回归正交旋转组合设计，设计了一组四因素五水平的共计31 次的实验（full CCD 设计），其中析因部分实验次数为16 次，星点数为6，保证均一精密性的中心点重复次数手动调整为7，本试验设计的因素及水平见表1。

表1 中心组合设计因素水平表Table 1 Central Composite Design factors levels table

1.2.2 红菜苔总多酚的提取

将红菜苔叶及皮晒干至手捏即碎，粉碎过80 目筛，准确称取1.00 g 干粉末，按照中心组合设计试验中设置的不同提取条件分别进行浸提，离心收集各个提取条件下得到的提取液，备用。每个处理重复3 次。

1.2.3 标准曲线制作与红菜苔总多酚的测定

参照邓义书等的方法，测定并绘制没食子酸标准曲线[8]，得吸光度值y 与没食子酸标准溶液浓度（x，mg/mL）之间的回归方程为y=0.055 2x-0.030 5，决定系数R2值为0.992 4。这表明，没食子酸质量浓度与吸光度值具有良好的线性关系。

取40 μL 红菜苔叶和皮的多酚提取液于10 mL 试管中，加水3.16 mL，加200 μL Folin-Ciocalteau 试剂，混匀，在30 s 至8 min 内加入600 μL 2 % 碳酸钠溶液，混匀，于20 ℃保温2 h，在765 nm 波长下比色，每样重复测量3 次，取平均值。

1.2.4 数据处理

实验数据采用Design Expert 软件进行多元回归及方差分析。

2 结果

2.1 试验结果

试验结果如表2 所示。

表2 响应曲面分析试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.2 模型的建立及方差分析

利用Design—Expert 软件对试验结果进行回归及方差分析（分析结果见表3），发现本研究符合二次方模型，经过响应曲面法的拟合计算得出该模型的决定系数R-Squared 为0.968 2，表明该模型具有较高的可信度；校正系数RAdj=0.940 3 表明在多酚含量总的变异中，有94.03%是由独立变量引起的。R-Squared 失拟项用来检测回归模型与实际试验值的拟合程度的好坏。如果失拟项显著，说明影响响应值的还有除温度、保温时间、乙醇浓度以及液固比以外的其它因素。失拟项的F=0.87，对应的P=0.595 9＞0.05，失拟项不显著，从而表明该模型能够对红菜苔多酚的提取进行预测和分析。图1 分析了模型的适应性，由图1 也可知，试验值大致对称分布于预测值两侧，与预测值也比较接近，这说明该模型适应性较高。

图1 试验值与预测值对比图Fig.1 Contrast diagram between actual values and prediction

红菜苔多酚提取的方差分析结果见表3。

表3 二次多项式模型方差分析表Table 3 Variance analysis of quadratic multinomial model

通过方差分析可对模型的精确性做进一步的判断，该模型的F 值为34.76，因误差而接受该模型的概率不到0.000 1，这表明模型的可信度很高，具有重要的参考价值；如果以0.05 作为显著性标准的话，在该模型中，A、C、D、AD、BC、CD、C2、D2是显著的模型项，表明温度、乙醇浓度和液固比是影响红菜苔多酚提取的关键性因素。

去掉不显著的交互作用项，手动优化可得简化的回归方程为：

优化后模型的F 值52.32，对应的P ＜0.000 1，因误差而接受该模型的概率不到0.000 1，失拟项的F=0.92，对应的P=0.588 1＞0.05，失拟项不显著；决定系数R-Squared 为0.957 3，校正系数RAdj为0.939 0，优化后的决定系数与校正系数之差小于优化前两者之差，表明优化后的回归方程具有更高的可信度。

2.3 响应曲面分析

利用Design Expert 7.0.0 软件对表2 数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的等高线及其响应面见图2、图3 和图4。

图2 提取温度和液固比的等高线和响应曲面图Fig.2 Contour figure and response surface graph between extraction temperature and liquid-solid ratio

图3 提取时间和乙醇浓度的等高线和响应曲面图Fig.3 Contour figure and response surface graph between extraction time and ethanol concentration

图4 乙醇浓度和液固比的等高线和响应曲面图Fig.4 Contour figure and response surface graph between ethanol concentration and liquid-solid ratio

通过二次模型所得到的等高线及响应曲面来判断试验因素之间的交互作用强度以及确定各因素的最佳水平范围。曲线越陡，说明因素间的交互作用越强；图形中曲面颜色越深的区域，说明结果越显著。

由图2 可知：曲线比较陡，表明提取温度（A）和液固比（D）之间的交互作用显著；当提取时间固定为2.5 h，乙醇浓度固定为65.0%，在提取温度不变的条件下，液固比在20～50∶1 的范围内，随着液固比值的升高，红菜苔多酚提取量逐渐增加。

由图3 可知：曲线很陡，近似直线，表明提取时间（B）和乙醇浓度（C）间的交互作用极显著；当提取温度固定为45.5 ℃，液固比固定为35∶1 时，在提取时间不变的条件下，乙醇浓度值在50%～80%范围内，随着浓度的升高，红菜苔多酚提取量逐渐增加，在65%附近达到最大值，随后随着乙醇浓度的增加，红菜苔多酚提取量逐渐减少。

由图4 可知：该曲线没有图2 和图3 陡峭，但仍有一定的陡峭度，表明乙醇浓度（C）和液固比（D）间的存在着一定的交互作用；当提取温度固定为45.5 ℃，提取时间固定为2.5 h，在乙醇浓度不变的条件下，液固比在20～50∶1 的范围内，随着液固比值的的升高，红菜苔多酚提取量逐渐增加。

上述等高线和响应曲面分析结果与表3 所示方差分析结果是一致的。

2.4 参数优化与验证

R 的物理意义是每克红菜苔皮和叶混合物提取多酚的毫克数，在Design Expert 7.0.0 软件的优化（optimization）模块中，将优化标准设置为最大值，求解得R 的最优值是1.529 3 mg/g，预测的最佳实验条件为：温度59.68 ℃，提取时间2.67 h，乙醇浓度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g）。为检验优化条件的准确性，按照上述优化过的工艺参数，重复试验3 次，得其平均值为1.513 6 mg/g，与预测值相差1.027%，实验值与预测值基本吻合。

3 结论

1）经过响应曲面法拟合计算得出二次方模型的决定系数R-Squared 为0.968 2，校正系数RAdj=0.940 3，通过方差分析可对模型的精确性做进一步的判断，该模型的F 值为34.76，因误差而接受该模型的概率不到0.000 1，具有较高的可信度，能够对红菜苔多酚的提取进行预测和分析。

2）响应曲面分析表明，提取温度、乙醇浓度和液固比对红菜苔叶和皮中多酚得率有极显著的影响（P<0.01），计算得到的回归方程为：R=-3.494 82-0.005 7A+0.398 9B+0.109 3C+0.037 1D+0.003 1AD-0.006 0BC-0.0002CD-0.0007C2-0.0004D2，决定系数为0.9573。

3）应用响应曲面分析法（RSA），确定从红菜苔叶和皮中用乙醇浸提多酚的最优提取条件为：提取温度59.68 ℃，提取时间2.67 h，乙醇浓度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g），预测最优提取量是1.529 3 mg/g。用上述优化过的工艺参数进行提取，得其平均值为1.5136mg/g，与预测值相差1.027%，实验值与预测值基本吻合。这表明采用响应面曲优化的红菜苔多酚乙醇浸提工艺，对于利用红菜苔叶和茎皮提取多酚具有一定的指导意义。

[1]李伟,张赟.红菜苔红色素的稳定性研究[J].食品科学,2010,31(15)：135-138

[2]孙建霞,孙爱东,白卫滨.苹果多酚的功能性质及应用研究[J].中国食物与营养,2004(10)：38-39

[3]宁立江,狄莹,石碧.植物多酚与利用的意义及发展趋势[J].化学进展,2000,12(2)：162-163

[4]邵芳芳,尹卫平,梁菊.重要的植树多酚及其抗氧化性能的研究概况[J].西北药学杂志,2010,25(1)：66-67

[5]李南薇,詹金广,陈少航.茶多酚分离提取和应用研究进展[J].天津农业科学,2010,1(4)：8-10

[6]杨立军.葡萄多酚的研究现状[J].海峡药学,2009,21(6)：103-104

[7]沈维治,廖森泰,刘吉平,等.植物多酚抑菌作用的研究进展[J].天然产物研究与开发,2009(2)：282-285

[8]邓义书,包海蓉,齐知耕.桑椹果渣中总多酚的不同提取方法比较研究[J].湖南农业科学,2010(15)：106-108