HPLC法测定奶粉中痕量炔雌醇

谭 芳，黄 璐，郑 琦，陈 燃

（江汉大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056）

HPLC法测定奶粉中痕量炔雌醇

谭 芳，黄 璐，郑 琦，陈 燃

（江汉大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056）

建立了高效液相色谱（HPLC）法测定奶粉中炔雌醇残留量的方法。样品以乙腈振荡萃取、离心，提取液浓缩后经0.45 μm滤膜过滤，冷冻去脂，进高效液相色谱仪分析。研究了萃取溶剂、萃取及浓缩方式对萃取效率的影响，确立了色谱检测条件。乙腈-水（50∶50）为流动相，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长224 nm。方法的检出限为16 μg/kg，加标回收率在86.5%～97.0%之间，工作曲线的相关系数为0.999 0，相对标准偏差为0.95%～2.01%（n=3）。方法快速、灵敏度高、分离效果好，样品处理简单、无杂质干扰，能够满足奶粉中雌激素分析的需要。

HPLC；奶粉检测；炔雌醇；食品安全

牛奶中所含雌激素过高将导致儿童性早熟，也致使成年人发生乳腺或者妇科肿瘤以及前列腺癌［1-2］。因此，快速准确地检测牛奶制品中的雌激素对于保障食品安全十分必要。目前，国家出台的标准中［3-4］，仅对牛奶中的雌激素建立了检测方法，而奶粉的检测方法尚无现行的国家标准。由于奶粉配方基质复杂，激素残留量低，建立快速、准确的方法来解决奶粉中的雌激素检测问题很有必要。笔者对奶粉中的炔雌醇进行提取、净化处理，建立了高效液相色谱法分析奶粉中炔雌醇的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 DIONEX高效液相色谱仪（配有GP50型梯度泵，TCC-100柱温箱，UVD170U型紫外检测器），美国戴安公司；色谱柱：Thermo C18柱（250 mm×0.46 mm，5 μm），美国热电公司；HZQ-C空气浴振荡器，金坛市天竟实验仪器厂；旋转蒸发仪RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；800型低速离心沉淀机，中国深圳国华仪器厂；微孔滤膜（孔径 0.45 μm）；DENVER instru⁃ment电子天平；离心管（10 mL，具塞带刻度）。

1.1.2 试剂 对照品炔雌醇由德国进口；甲醇、乙腈为色谱纯；无水乙醇为分析纯；实验用水为双蒸水。

精密称取炔雌醇对照品25 mg，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇振摇使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，存放于冰箱备用。样品为市场购得的孕妇奶粉、婴幼儿配方奶粉、中老年营养奶粉。

1.2 样品处理

称取2.0 g奶粉试样于50 mL离心管中，加25 mL乙腈混匀，置于空气浴振荡器振荡萃取20 min，4 000 r/min离心10min，吸取上层清液，用过滤膜过滤，收集滤液置于-24℃下冷冻4 h，用过滤膜操作去除脂肪。精密量取萃取液10 mL，30℃下旋转蒸干，加无水乙醇定容至0.2 mL，进入液相色谱仪分析检测。

1.3 色谱条件

流速1 mL/min；柱温30℃；流动相：乙腈-水（50∶50）为流动相；检测波长224 nm；进样量20 μL。在选定色谱条件下，对照品色谱图见图1。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验比较了70%甲醇（体积比，流动相为甲醇-水）和50%甲醇，以及40%乙腈（体积比，流动相为乙腈-水）、50%乙腈、60%乙腈条件下，对比炔雌醇标准液的检测效果，发现甲醇作为流动相有机相时基线不稳定，干扰较大。而在50%乙腈条件下，同时选择不同浓度标准溶液进行液相色谱检测，炔雌醇保留时间较为合适，且在不同浓度下，目标峰周围无杂质干扰，峰宽适宜，所以最终确定选择乙腈-水（50∶50）作为流动相。

图1 炔雌醇对照品色谱图

2.2 波长的选择

在200～800 nm波长光谱扫描炔雌醇标准溶液发现，炔雌醇有两个吸收峰，分别在224 nm处和280 nm处，而224 nm处吸收峰信号更强一些。而在此波长下进行HPLC检测，杂质干扰也较小，可以获得更高的灵敏度，因此选择224 nm作为检测波长。

2.3 萃取剂的选择

奶粉样品主要成分是蛋白质和脂肪，同时也是干扰物的主要来源，因此奶粉中蛋白质和脂肪的去除以及待测组分的提取是样品前处理过程的关键。参照各种相关文献发现［5］，萃取剂一般为乙酸乙酯、乙醇、乙腈和氯仿。通过实验探索发现，乙醇萃取离心后溶液仍较浑浊，过滤膜阻力较大；乙酸乙酯旋蒸后呈深土黄色，杂质干扰太多；氯仿萃取后，由于脂肪易溶于氯仿，造成干扰，且提取回收率很低，不能满足实验要求；乙腈提取后溶液澄清，干扰少，回收率也较高，因此本实验确定乙腈作为萃取剂。

2.4 萃取方式的选择

在实验中考察了固相萃取及液相萃取的条件，发现固相萃取虽然可以去除一些杂质，但回收率却降低了很多，而液相萃取后直接进样，杂质干扰较小。液相萃取过程中又同时比较振荡萃取和超声萃取的区别，最终发现当超声和振荡时间超过30 min，回收率差异较小，但超声萃取后溶液容易出现乳化现象，离心后溶液比较浑浊，过滤膜阻力特别大，故而最终选择了振荡萃取。

2.5 浓缩方式的选择

由于一般食品中雌激素含量低，一般仪器很难检测出，因此选择有效的浓缩富集方式非常重要。由于固相萃取富集效果不太理想，有效成分损失较大，又由于萃取液量较多，不适合选用氮吹仪，因此浓缩方式选择水浴蒸干和旋转蒸干两种，但普通的水浴蒸干，所需时间很长，蒸干残渣中干扰杂质多，原因可能是长时间在高温蒸干过程发生了复杂的反应，溶液吸光度会随温度增高而增大，目标提取物也会因此损失。而旋转蒸发仪是在真空低温下进行，一般不会改变物性，且时间较快，只需要5～10 min，具有较明显的优势，因此确立选择旋转蒸发仪来蒸干萃取液。

2.6 方法的线性范围、检出限、定量限

精密量取炔雌醇贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分别置于50 mL的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得到2.5，5.0，10，15，25 μg/mL浓度梯度的标准溶液，在优化的色谱条件下分别进样。采用外标法，根据峰面积与浓度的关系绘制标准工作曲线，以3倍信噪比（S/N）计算检出限，以10倍信噪比（S/N）计算定量限。线性方程为C=2.743 9A+0.315 9，相关系数0.999 0，方法的检出限为 16 μg/kg，定量限为 60 μg/kg。从实验结果可以看出线性关系良好。

2.7 方法的回收率与精密度

取奶粉样品2.0 g，分别加入2.5 mL炔雌醇浓度为5.0，25，250 μg/mL标准溶液，然后按照1.2实验方法处理，每组平行3次实验，分别得到低中高3个浓度下的回收率，所得结果如下表1。

表1 加标回收率及精密度实验

从表1可知，加标回收率在86.5%～97.0%之间，相对标准偏差为0.95%～2.01%（n=3），可见本实验的准确度与精密度良好。

2.8 样品分析

采用本法对市售3个品牌的孕妇奶粉、婴幼儿配方奶粉、中老年营养奶粉进行测定，所有样品均低于本方法检出限，均未检出炔雌醇，同时在检测过程中，未发现有其他明显的干扰。

3 结论

应用建立的HPLC法测定奶粉中炔雌醇残留，加标回收率在86.5%～97.0%之间，相对标准偏差为0.95%～2.01%（n=3），实验结果表明，该方法试剂用量少，无较多的干扰物产生，操作简单、快速、准确、成本低。HPLC法应用于奶粉中炔雌醇残留量的检测，可以得到满意的结果。

［1］ 沈珺，徐莹.浅论牛乳中的雌激素［J］.黑龙江科技信息，2011（27）：184.

［2］ 袁丽君，徐庄剑，许祥生.牛奶中的雌激素及其安全性［J］.国际内科学杂志，2007，34（4）：712-714.

［3］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21981-2008.动物源食品中激素多残留检测方法（液相色谱-质谱法）［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［4］ 中华人民共和国农业部.农业部1031号公告-1-2008.动物源性食品中11种激素残留检测液相色谱－串联质谱法［S］.北京：中国农业出版社，2008.

［5］ 刘勇军，吴银良，姜艳彬，等.固相萃取气相色谱-质谱联用法测定牛奶中的炔雌醇［J］.畜牧与兽医，2007，39（9）：53-54.

Determination on Residue of Ethinylestradiol in Powdered Milk with HPLC

TAN Fang，HUANG Lu，ZHENG Qi，CHEN Ran
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

A method was developed for the determination of ethinylestradiol residue in pow⁃dered milk with HPLC.Samples were extracted with acetonitrile，contrifugated，the extract was fil⁃trated with 0.45 μm filter membrane after being concentrated，freezed and degreased，then carried out HPLC analysis.Extraction solution，extraction method and HPLC condition were optimized.Used acetonitrile-water（50∶50）as the mobile phase，flowing speed was 1 mL/min，column tempera⁃ture was 30℃，detective wavelength was 224 nm.The detection limit of the method was 16 μg/kg，the recovery was 86.5%-97.0%，the related coefficient of the working curve was 0.999 0，the rela⁃tive standard deviation was 0.95%-2.01%（n=3）.The method is rapid，sensitive，good seperation effect，simple，no disturbance from impurity，can meet the request of etinylestradiol dectection in powdered milk.

HPLC；detection on powdered milk；ethinylestradiol；food security

O657.72

：A

：1673-0143（2013）06-0031-03

（责任编辑：叶 冰）

2013－10－21

湖北省科技厅项目（2011CDC130）；武汉市科技局项目（201220837304-3）

谭 芳（1973—），女，实验师，硕士，研究方向：仪器分析教学与科研。