荧光光谱法研究昂丹司琼与人血清白蛋白的相互作用

王 琛

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西省眼科医院，山西 太原 030002）

荧光光谱法研究昂丹司琼与人血清白蛋白的相互作用

王 琛1,2

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西省眼科医院，山西 太原 030002）

目的利用荧光光谱法研究昂丹司琼(OND)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。方法采用荧光光谱法。结果在296K和310K时OND与HSA的结合常数分别为3.24×104L/mol，4.68×104L/mol，热力学参数ΔH为20.08kJ/mol。结论OND对HSA的荧光猝灭机制主要为静态猝灭，二者有一个结合位点，其作用力类型以疏水作用力为主。

昂丹司琼；人血清白蛋白；荧光光谱

昂丹司琼（Ondansetron，OND）为一种新型强效、高度选择性的5-HT3受体拮抗剂，已广泛地应用于治疗各种原因所致的恶心、呕吐[1-2]。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人体血浆中含量最为丰富的载体蛋白，含量约为0.6mmol/L，约占人体内血浆总蛋白含量的60%[3-5]。探讨药物小分子与蛋白的相互作用，对于研究药物的作用机制具有重要的指导意义。近些年已有不少关于药物小分子与HSA相互作用的报道，但尚未见采用荧光光谱研究OND与HSA相互作用的报道。本实验采用荧光光谱法研究了OND与HSA的相互作用，并讨论了OND对HSA的猝灭机制、结合常数以及结合力类型等，对于阐明昂丹司琼的体内过程具有一定意义。

1 仪器与试剂

F2500荧光光度计（日本日立公司）；AY-120M电子分析天平（日本岛津公司）；SYC-15超级恒温水浴（南京桑力电子设备厂）；Biohit加样器（芬兰，biohit公司），PHS-3C数字酸度计（上海雷磁分析仪器厂）。

昂丹司琼（济南德诚和牧医药科技有限公司，纯度99%），人血清白蛋白（HSA，上海生物制品研究所，纯度95%，分子量66500），三羟甲基氨基甲烷（Tris），所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，经检测均无荧光杂质。

2 实验方法

按照文献方法[6-9]依次配置Tris-HCl缓冲溶液，1.0×10-5mol/L的HSA溶液，5.5×10-3mol/L的OND溶液。用加样器移取2mLTris-HCl缓冲溶液和100μLHSA母液置于1cm的石英池中，然后逐次加入2μL的OND母液，在F2500荧光光度计上设置280nm为激发波长，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm，在波长300～455nm范围内以1200nm/ min的速度扫描荧光光谱并测定荧光强度。

3 结果与讨论

3.1 昂丹司琼与HSA结合的荧光光谱

根据实验方法扫描荧光发射光谱，见图1。 由图1可知，昂丹司琼可猝灭HSA的内源性荧光。其作用过程遵循Stern-Volmer方程[10]：

式中，F0为猝灭剂不在时的荧光强度；F为加入猝灭剂后的荧光强度；[Q]为猝灭剂Q的浓度；Kq为双分子猝灭速率常数；τ0为荧光体的荧光寿命；KD为Stern-Volmer方程的猝灭常数。

图1 昂丹司琼与HSA作用的荧光猝灭光谱[HSA]= 0.5×10-6mol/L，[OND]=(0，0.55，1.10，1.65，2.20，2.75，3.30，3.85，4.40，4.95，5.50)×10-5mol/L

3.2 荧光猝灭及碎灭机理

本实验分别测定了293K、310K温度下，昂丹司琼对HSA的内源性荧光产生猝灭的情况。以F0/F对药物浓度[Q]作图，结果见图2，由Stern-Volmer曲线的斜率即可求得猝灭常数KD，根据Kq=KD/τ0，τ0≈10-8s可进一步求得Kq，所求得的Kq和KD见表1。

由图2可以看出，昂丹司琼对HSA分子荧光猝灭的Stern-Volmer曲线斜率随着温度升高而降低，结果表明昂丹司琼对HSA分子荧光猝灭效率随温度升高而降低，符合静态猝灭的特征[10]，据此可以判断，昂丹司琼对HSA分子的荧光猝灭属于静态猝灭。此外，表1中不同温度下Kq值均远大于2.0×1010L/（mol·s），进一步证实昂丹司琼对HSA分子的荧光猝灭属于静态猝灭。

图2 昂丹司琼与HSA作用不同温度下的Stern-Volmer曲线

3.3 结合位点数n和结合常数K的确定

以Lg（F0/F-1）对Lg[Q]作图3，由图3中直线的斜率和截距可求出昂丹司琼与HSA分子的结合位点数 和结合常数 ，结果见表1。由表1可知，昂丹司琼与HSA有一个结合位点，此外随着温度的升高结合常数K由3.24×104L/mol增大至4.68×104L/mol，说明温度的升高使昂丹司琼与HSA形成的复合物的稳定性增强。

图3 不同温度下昂丹司琼与HSA作用的双对数曲线

3.4 昂丹司琼与HSA之间相互作用力类型的确定

结合本实验中昂丹司琼与HSA在不同温度下的结合常数，可以求得昂丹司琼与HSA结合作用过程中的焓变ΔH，熵变ΔS，吉布斯自由能的变化ΔG等热力学参数，结果见表1。

从表1数据中可以看出OND-HSA体系中ΔH＞0，ΔS＞0，说明昂丹司琼与HSA之间作用力是以疏水作用力为主[11，12]。ΔH＞0，说明分应为吸热反应，进一步证实温度的升高，有利于昂丹司琼与HSA结合反应的进行。

4 结 论

本实验利用荧光光谱法研究了昂丹司琼与HSA的相互作用，结果表明，昂丹司琼对HSA的内源性荧光有明显的猝灭机制主要为静态猝灭，结合位点数约为1，昂丹司琼对HSA作用力类型主要为疏水作用力。

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表1 昂丹司琼与HSA的猝灭常数与热力学参数

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Study on the Interaetion for Human Serum Albumin with Ondansetron by Fluorescence Spectrometry

WANG Chen1,2

(1 Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Shanxi Eye Hospital, Taiyuan 030002, China)

ObjectiveStudy on the interaetion for human serum albumin with ondansetron by Fluorescence Spectrometry.MethodsFluorescence spectrometry was used.ResultsThe binding constants were 3.24×104L/mol, 4.68×104L/mol. The thermodynamic parameters ΔH was 20.08kJ/mol.ConclusionThe fluorescence quenching of HSA by OND indicated that the quenching mechanism was a static quenching, and the thermodynamic parameters showed that the interaction of OND and HSA was mainly driven by hydrophobic force.

Ondansetron; Human serum albumin; Fluorescence spectrometry

R914

B

1671-8194（2013）15-0010-03