甲型流感患者CD4和CD8因子的变化及其临床意义

龙光艳 刘 梅 王建华 李娜娜 陈 玲*

（遵义医学院附属医院呼吸二科，呼吸医学研究室，遵义 563003）

甲型流感患者CD4和CD8因子的变化及其临床意义

龙光艳 刘 梅 王建华 李娜娜 陈 玲*

（遵义医学院附属医院呼吸二科，呼吸医学研究室，遵义 563003）

目的检测甲型流感患者外周血CD4及CD8因子，了解CD4+和CD8+T淋巴细胞的动态变化及其临床意义。方法收集年龄在20～55周岁之间有明显流感病毒感染症状患者的鼻咽拭子，将经流感病毒NP基因片段鉴定确诊的甲型流感患者作为研究对象，分别于感染后不同时间段采取外周血，离心取血清，应用双抗体夹心技术（ELISA）测定流感患者血清中CD4及CD8因子进行检测及分析。结果经ELISA检测，显示经流感病毒NP基因检测确诊的4例甲型流感患者中，所有病例CD4、CD8因子在感染3天时均呈下降或下降趋势，在感染7d时表达水平逐渐升高；从表达水平观察，CD4因子表达水平较低，而CD8因子处于较高水平的表达。结论流感病毒感染人体后可导致T淋巴细胞水平的改变，在感染初期1～3d，CD4及CD8因子呈下降或下降趋势，提示CD4+和CD8+T淋巴细胞功能受到不同程度的抑制；在感染7～14d，CD4及CD8因子表达逐渐升高并可达高峰值，可能参与病毒的清除，在引发机体免疫应答中发挥重要作用。

ELISA；T淋巴细胞；CD4；CD8；流感病毒

近年来，由于新的流感病毒重组变异株的出现，给世界卫生造成实质性的威胁，其中包括2009年的H1N1流感病毒株[1]。甲型H1N1流感病毒基因组由禽流感、猪流感和人流感病毒基因混合而成，是一种新型病毒，并且人类普遍易感[2]。中国卫生部数据显示，截止2010年1月2日中国地区确诊的H1N1病例为12.094万人，死亡病例为659人[3]。流感疫情暴发的形式越来越复杂，引起了世界范围的广泛关注。

在流感病毒感染时，体液免疫和细胞免疫在疾病的严重程度及转归上都可能发挥着重要的作用[4]。构成机体免疫系统的淋巴细胞主要有T、B淋巴细胞，但机体对抗病毒感染主要是特异性T淋巴细胞免疫反应，人体免疫内环境的稳定是由T淋巴细胞各亚群的比例来进行调节和维持的[5]。T淋巴细胞亚群包括CD4+T和CD8+T，CD4+T细胞的主要功能是辅助抗体的应答，而CD8+T细胞是抗流感病毒细胞免疫的主要效应细胞。在流感病毒感染的急性期，CD4+和CD8+T细胞通过产生细胞因子调节肺部炎症变化，提示着CD4+和CD8+T可能与流感病毒感染密切相关。本课题用ELISA法对流感患者感染不同时间的外周血CD4、CD8进行动态检测，了解CD4+和CD8+T淋巴细胞的动态变化及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 对象

选择2010年10月至2011年2月本院门诊确诊为流感的患者。纳入标准：发热、咽痛、流涕、鼻塞、咳嗽、咯痰、头痛、全身酸痛、乏力；部分病例出现呕吐和/或腹泻；少数病例仅有轻微的上呼吸道症状，无发热；体征主要包括咽部充血和扁桃体肿大。

1.2 仪器和试剂

酶标仪（BIO-RAD，iMark，美国）；CD4酶联反应试剂盒（10-25-695）及CD8酶联反应试剂盒（10-25-696）均为美国R&D公司产品。

表1 CD4、CD8在流感患者不同时间的表达水平（χ—±s，μg/L）

1.3 实验方法

对符合纳入标准的流感患者鼻咽拭子进行病毒RNA的提取及扩增、鉴定；鼻咽拭子甲型流感病毒NP基因片段PCR扩增，凝胶电泳。

NP引物序列：NP-F：5'-AGAGGATGGTGCTTTCTGC-3'NP-R：5'-CCA TCATTCTTATAACTTCTG-3'；PCR扩增反应条件：Step1（1cycle）：95℃2min， Step2（41cycles）： 95℃20S，55℃ 20S，68℃ 1min30S，Step3（1cycle）；68℃7min。

外周静脉血采集：经鼻咽拭子流感病毒核蛋白NP基因片段鉴定后的患者，在感染3d、7d、14d及2月后（自身正常对照，记为0天）用EDTA处理的采血管分别采取外周血，每次3mL，以3000g离心10min，取上清保存于-80℃冰箱中备用。

流感病毒患者血清CD4及CD8细胞因子检测：严格按仪器和酶联免疫吸附试剂盒说明书操作。统计处理：采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学处理，用均数±标准差（χ—±s）表示。

2 结 果

2.1 采集流感样症状患者鼻咽拭子12份（男性5份，女性7份，年龄20～55岁）。

2.2 12份标本经甲型流感病毒NP基因鉴定，筛查出甲型流感病例4例（病例1，2，3，4）。

2.3 血清CD4及CD8细胞因子表达情况

经ELISA检测，病例1、病例4CD4在感染3d时均呈下降或下降趋势，4例患者在感染7～14d CD4表达水平有不同程度的升高；其中病例2、病例3及病例4在感染7d CD4的表达水平较高，而病例1在感染14d CD4表达水平较高。病例1及病例4 CD8在感染3d时均表达下降，4例患者在感染7～14d CD8表达水平有不同程度的升高；其中病例2及病例3在感染7d时CD8的表达水平较高，而病例1及病例4在感染14d CD8表达水平较高。从表达水平观察，CD4因子表达水平较低，而CD8因子处于较高水平的表达。病例1 CD4及CD8分子在感染3d时均表达下降，感染7d逐渐上升，均在感染14d表达达高峰。病例2及病例3 CD4及CD8分子均在感染7d表达达高峰。病例4 CD4及CD8分子在感染3d时均表达下降，感染7d逐渐上升，其中CD4在在感染7d表达达高峰，而CD8在感染14d时表达达高峰，见表1。

3 讨 论

成熟的T细胞表达CD4或CD8分子，即CD4+T细胞或CD8+T细胞。CD4和CD8分子的主要功能是辅助TCR识别抗原和参与T细胞活化信号的转导。因此本实验通过检测外周血中C D4及CD8的变化，判断CD4+和CD8+细胞在流感患者中的表达情况。

动物实验研究发现感染猪流感H1N1亚型病毒5～6d时CD4+T、CD8+T细胞可达高峰值[5]；但在国内外文献研究大多数认为流感患者存在T淋巴细胞亚群免疫功能障碍，彭华保等人[6]研究显示流感患者病程初期（1～3d）CD4+T、CD8+T表现为抑制状态；并认为，病情越重T淋巴细胞亚群的抑制越明显，恢复期明显上升[6-7]。其他相关文献报道认为在流感感染初期CD4+T细胞呈下降的，之后逐渐升高。本研究显示，确诊的4例甲型流感患者中，从表达水平观察，CD4因子表达水平较低，而CD8因子处于较高水平的表达。所有病例CD4、CD8因子在感染1～3d时均呈下降或下降趋势，与以上文献报道一致，提示着甲型流感患者早期淋巴细胞亚群功能即受损表现为全面抑制状态；4例病例在随着病情的恢复在感染7～14d，CD4及CD8因子表达逐渐升高并可达高峰值，提示可能参与病毒的清除，在引发机体免疫应答中发挥重要作用，并且外周血T淋巴细胞亚群的变化对估计病情的转归和预后具有重要的作用。4例病例CD4及CD8表达最高值的时间不同，可能与患者的病程进展不同有关。Annette Fox[8]等人研究显示，CD8+T细胞的激活应答和分化应答是不同的，在轻型流感患者中其表达是快速、短暂的和适度的，但在重症流感患者中其表达延迟和/或过度的，其研究中60%的重症流感患者CD8+T细胞计数低于正常值范围，而其他患者其CD8+T计数值有表达在正常范围内的、也有高表达以及过度表达的。提示着CD8

+T在甲型流感患者中的表达可能与病情的严重程度有关，其具体的作用机制有待进一步研究。总之，本研究显示，流感感染可导致CD4+和CD8+T淋巴细胞水平的改变，提示着流感患者外周血T淋巴细胞亚群可能在流感病程中发挥着重要作用。流感病毒与T淋巴细胞亚群相互关系的进一步研究，对流感的诊断、治疗和预后估计有重要的临床意义。

[1] Teijaro JR,Verhoeven D,Memory CA.CD4 T cells Direct Protective Responses to Influenza Virus in the Lungs THROUGH Helper-Independent Mechanisms[J].J Virol,2010,84(18):9217-9226.

[2] Novel Swine-Origin Influenza A(H1N1)Virus Investigation Tem, Dawood FS,Jain S,et al.Emergence of a novel swine.origin influenza A(H1N1)virus in humans[J].N Engl J Med,2009,360(25): 2605-2615.

[3] Guo XC.Dynamic variations in the peripheral blood lymphocyte subgroups of patients with 2009 pandemic H1N1 swine-origin influenza A virus infection[J].Virol J,2011,215(8):1-6.

[4] Baluch A,Long Term Immune Responses to Pandemic.Influenza A/H1N1 Infection in Solid Organ Transplant Recipients[J].PLoS ONE,2011,6(2):1-6.

[5] Lange E.Pathogenesis and transmission of the novel swine-origin influenza virus A/H1N1after experimental infection of pigs[J].J Gen Virol,2009,90(9):2119-2123.

[6] 彭华保.重型甲型H1N1流感患者T淋巴细胞亚群变化分析[J].医学临床研究,2011,28(6):1092-1093.

[7] 陈颖.重症甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞亚群变化的临床意义探讨[J].中国医科大学学报,2011,40(2):140-143.

[8] Annette Fox,Severe Pandemic H1N1 2009 Infection Is Associated with Transient NK and Deficiency and Aberrant CD8Responses[J]. PLoS ONE,2012,7(2):1-10.

R373.1+3

B

1671-8194（2013）11-0076-02

贵州省优秀科技教育人才省长基金(黔省专合字2010-68)

*通讯作者：lingjuncd@163.com