高同型半胱氨酸对小鼠足细胞CD2AP表达的影响

张晓亮 柳 洁* 马春明 张姬欣 高 颖

（山西医科大学，山西 太原 030012）

高同型半胱氨酸对小鼠足细胞CD2AP表达的影响

张晓亮 柳 洁* 马春明 张姬欣 高 颖

（山西医科大学，山西 太原 030012）

目的 观察α-硫辛酸对高同型半胱氨酸（Hcy）作用下小鼠足细胞胞CD2AP mRNA表达的影响，探讨α-硫辛酸对足细胞的保护作用。方法 将体外培养的足细胞分为正常组、Hcy组、Hcy+α-硫辛酸组，培养24、48、72h时分别收集细胞，RT-PCR法检测CD2AP mRNA表达。结果 Hcy组，足细胞CD2AP mRNA表达自24h开始下调（P＜0.05），且有一定的时效性，72h达到下调高峰（P＜0.01）；Hcy+α-硫辛酸组，48h时，CD2AP mRNA表达较Hcy组增高（P＜0.05），72h仍有上述差异（P＜0.05）。结论 α-硫辛酸对足细胞有一定的保护作用，可能与其可对抗高同型半胱氨酸下CD2AP mRNA表达下调有关。

同型半胱氨酸；足细胞；α-硫辛酸；Nephrin

近年来，同型半胱氨酸（Hcy）作为一种血管反应性氨基酸，其在糖尿病微血管并发症中的作用越来越受到大家的关注，随着对足细胞的研究和认识逐渐深入，足细胞裂孔隔膜蛋白表达异常在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）发病中的重要作用被逐渐认同，CD2AP作为裂隙孔膜蛋白的重要组成，其表达异常可导致足细胞裂孔隔膜的完整性被破坏，滤过屏障功能受损，直接影响DN的发生发展。本研究通过观察α-硫辛酸对高Hcy环境下足细胞CD2AP mRNA表达的影响，探讨α-硫辛酸对足细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

小鼠足细胞（复旦大学细胞中心）；RPMI1640细胞培养液（美国Hyclone公司）；无支原体胎牛血清FBS（杭州四季青生物有限公司）；含EDTA胰酶（美国Hyclone公司）；青链霉素（北京Solarbio公司）；小鼠γ-干扰素（美国Peprotech公司）；Hcy和α-硫辛酸（美国Sigma公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；引物由上海生物工程技术有限公司合成。超净工作台（上海力申科学仪器有限公司）；HF90/HF24二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司），7300 Real Time PCR System、PCR System 9700（美国ABI公司）；FC500流式细胞仪（美国贝克曼公司）。

1.2 细胞培养

细胞培养 足细胞培养方法参考 Mundel等[1]，细胞于含50 U/mLγ-干扰素，100U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10%（体积分数）胎牛血清的1640培养液中，在33℃细胞培养箱中培养传代。然后将细胞转入不含γ-干扰素的10%胎牛血清1640培养液，37℃细胞培养箱中诱导分化10～14 d后使用。分化成熟的细胞于不含胎牛血清的1640培养液中同步培养24h，根据不同的实验目的分组：正常组（等体积1640培养基）、高Hcy组（1mmol/L的Hcy）、混合组（1mmol/L的Hcy+0.5mmol/Lα-硫辛酸）。

1.3 Nephrin mRNA表达测定

按上述方法培养的细胞，分别于培养24、48、72h收集细胞，抽提细胞总RNA以RT-PCR半定量方法测定podocin mRNA表达, 引物序列见表 1。反应结束后，RT-PCR相对定量结果采用2- △△ CT法：ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。所有操作均按试剂盒说明书进行。见表1。

表1 RT-PCR测定引物RT-PCR testprimer sequence

1.3 统计学处理

每个实验设6个复孔，所有数据经SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料进行正态性检验后，统计结果以均数+标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，检验水准为α=0.05。

2 结 果

各组CD2AP mRNA表达如表1所示，与对照组相比，Hcy组及混合组CD2AP mRNA表达自24h开始呈下调趋势（P＜0.05），72h尤其明显（P＜0.01）；48h时混合组CD2AP mRNA较Hcy组表达增多（P＜0.05），72h仍有上述差异，说明α-硫辛酸可对抗高Hcy对CD2AP mRNA表达的下调作用。见表2。

表2 各组Nephrin mRNA表达变化（%，，n=6）

表2 各组Nephrin mRNA表达变化（%，，n=6）

注：以正常葡萄糖组作为对照组，其他各组分别作为实验组，由于计算而得的相对倍数均＜1，将结果以百分数形式进行统计，以正常对照组作为100，其余各组分别与对照组进行两独立样本t检验，与正常对照组相比，*表示P＜0.05；与同组24h相比，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；与同组48h相比，▲表示P＜0.05：与高Hcy组相比，#表示P＜0.05

组别时间24h48h72h高Hcy组46.83±3.26*28.07±0.93*△16.44±1.44*▲混合组41.06±4.11*36.79±1.89*△#25.36±1.57*▲△△#

3 讨 论

Hcy是一种反应性血管损伤氨基酸，近年来研究表明，Hcy不仅是心、脑血管疾病的独立危险因素，其与糖尿病微血管并发症的发生、发展也存在一定的关联。有文献报道[2]，高Hcy血症是DN 的危险因素。高Hcy 可通过促进活性氧过多产生致氧化应激激活多元醇、晚期糖基化终末产物（AGE）、PKC、己糖途径导致肾脏损伤，加速DN的进程[3]。本研究显示，高Hcy可下调足细胞CD2AP mRNA表达，且有一定的时效性，与上述报道一致。硫辛酸是一种强效的抗氧化剂，可清除包括氢氧自由基、单态氧、一氧化氮自由基、氢过氧化物等在内的多种氧化应激产物，维持机体正常的抗氧化水平。有研究发现[4]α-硫辛酸可抑制氧化应激所引起的核转录因子-κB信号通路的激活，从而减轻系膜细胞的增殖。α-硫辛酸能降低DN患者血浆中Hcy的水平，改善血管内皮功能，从而延缓糖尿病肾病的进展[5]。本研究还显示，48h时，混合组CD2AP mRNA表达较高同型半胱氨酸组增高，72h时仍有此差异，因此推测α-硫辛酸可对抗高Hcy对CD2AP mRNA的下调作用，可能与其抗氧化应激有关。

综上所述，高Hcy可下调足细胞CD2AP mRNA表达，α-硫辛酸可对抗此下调作用，但其具体作用机制仍需进一步研究。

[1] Mundel P,Reiser J,Zúñiga Mejía Borja A, et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines [J]. Exp Cell Res,1997,236(1):248-258.

[2] 李计元.同型半胱氨酸与血管疾病[J].医学综述,2008,14(5):712-714.

[3] 魏剑芬,程燕.糖尿病肾病患者血清同型半胱氨酸与氧化应激的关系[J].天津医药,2008,38(10):871-873.

[4] 李慧,贾一韬,韦多,等.α-硫辛酸对高糖诱导的系膜细胞核因子-κB活性的抑制作用[J].解放军医学杂志,2006,31(11):1074-1076.

[5] 孙丽,陈亘卓,刘丽,等.α-硫辛酸对2型糖尿病肾病患者高同型半胱氨酸血症及血管内皮功能的影响[J].中国医药指南,2011,9(27):223-224.

Effects of Alpha-lipoic Acid on the Expression of CD2AP in Mouse Podocytes Cultured in Homocysteine Environment

ZHANG Xiao-liang, LIU Jie, MA Chun-ming, ZHANG Ji-xin, GAO Yi
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, China)

Objective To observation the effect of the alpha-lipoic acid on the expression of CD2AP mRNA in mouse podocytes cultured in homocysteine environment,To explore the protective effects of alpha-lipoic acid on podocyte. Methods The podocytes were cultured in high homocysteine and alphalipoic acid environment and collected respectively at 24、48、72h, the mRNA expression of CD2AP was examined by RT-PCR. Result The expression of CD2AP mRNA was decreased, and there is a certain timelines, alpha lipoic acid can resist the trend. Conclusion Alpha lipoic acid has protective effect on podocytes, and it can resist down-regulating the expression of CD2AP mRNA.

Alpha lipoic acid; Homocysteine; Podocyte; CD2AP

R54

B

1671-8194（2013）19-0069-02

*通讯作者：E-mail： liujie6@medmail.com.cn