胃蛋白酶－胰蛋白酶两步体外消化法评定豆粕粉碎粒度

梁 明 杨维仁

(山东农业大学，泰安 271018)

饲料粉碎粒度对饲料消化利用和动物生产性能均有明显影响，对饲料的加工过程与产品质量也有重要作用［1］。粉碎过程通过破坏谷物种皮的保护，从而增大了饲料的表面积，增加了饲料与消化酶接触的机会，进而提高养分的消化利用率，改善饲料报酬。适宜的粉碎粒度可显著提高饲料的转化率，减少动物粪便排泄量，提高动物的生产性能，也利于饲料成分混合均匀，便于颗粒饲料的制作，提高制粒的效率和颗粒质量［2］。近年来对畜禽饲料粉碎粒度的研究，表明了粉碎粒度与制粒和畜禽生产性能的重要关系，各种畜禽的最适粉碎粒度的评定是粒度研究的关键［3］。

饲料粒度的测定方法目前主要有筛上物留存百分率法(两层筛法)［4］、几何平均粒度法(十四层筛法)、细度－均匀度模数法(七层筛法)［5］。其中十四层筛分法测定和计算虽然麻烦，但结果科学精确［6］。

饲料粉碎粒度的评定一般利用动物对饲料原料的消化率状况衡量。消化率的研究方法主要有体内消化法和体外消化法。体内法耗资、费力、效率低、重演性、可比性差，同时测值又受到种种条件限制［7］，体外法相对简单，快速，重复性好［8］。胃蛋白酶－胰酶两步体外消化法是目前公认的一种较好的测定蛋白质消化率的方法［9］。当前对饲料粉碎粒度的研究主要集中在玉米、小麦和高梁上［10－13］，对豆粕的研究不是很多。且现在对粉碎粒度的体外评定主要为单一原料粉碎粒度的研究，未发现对不同粉碎粒度原料制成配合饲料的体外研究。本试验通过胃蛋白酶－胰蛋白酶两步消化法测定不同粒度豆粕及不同粒度基础配制的粉状配合饲料、颗粒料的干物质和蛋白质的消化率，研究豆粕的最适粉碎粒度，探讨豆粕粉碎粒度与豆粕、粉状配合饲料及颗粒料消化率的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试验仪器

SFP－ZY多腔高效多功能粉碎机:唐山双义饲料机械;粉碎筛片(直径 1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、2.5 mm、3.0 mm);SZLH420 －150 制粒机:江苏溧阳正申机械;标准筛一套(直径200 mm);顶击式振筛机:浙江上虞五金紗织筛厂;恒温水浴振荡器、真空泵、布氏漏斗等。

1.2 商品酶

胃蛋白酶(活性1∶3000):北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司;胰蛋白酶(活性2 500 u/mg):阿拉丁化学有限公司;缓冲液:pH 1.4，0.05 mol/L，HCl－KCl缓冲液;pH 6.8，0.05 mol/L，KH2PO4－ NaOH 缓冲液。

1.3 试验待测样品

豆粕:水分(12 ±0.1)%，直径为 1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mm筛孔孔径的筛片粉碎获得。

粉状配合饲料、颗粒料:按照配方(表1)配料、混合，用压缩比1∶10、环模孔径3.2 mm的环模加工制粒。

表1 试验日粮配方组成

1.4 方法与测定

1.4.1 基础指标的测定

水分按GB/T 6435—2006进行。粒度按照GB 6971—1986《饲料粉碎机试验方法》进行。蛋白质、干物质以半微量凯氏定氮法及105℃烘干法测定饲料原料及消化处理后的饲料样品的含氮量及干物质含量。

1.4.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶最适浓度的确定［14－16］

1.4.2.1 胃蛋白酶最适酶量的选择

准确称取5份0.5 g豆粕(过40目)于250 mL培养三角瓶中，加入 pH 1.4 的0.05 mol/L HCl－ KCl缓冲液30 mL。每个三角瓶加入含不同胃蛋白酶活性单位(10、30、50、70、90 mg/mL 的 HCl－ KCl缓冲液配置)的溶液各1 mL，再加入0.5 mL细菌生长抑制剂(0.5%的氯霉素)，盖上橡胶塞，将三角瓶置于(37±0.1)℃台式恒温摇床(恒温水浴振荡器)中，以其温度达到37℃开始计时，振荡(80次/min)3 h。

使用真空泵和布氏漏斗进行抽滤(过滤前，滤纸须称重，铅笔标号)，多次冲洗残留物，残渣处理:(1)消化结束后，在三角瓶中加入5 mL 20%的磺基水杨酸溶液.室温放置30 min沉淀蛋白质;(2)过滤，将三角瓶残留物用1%磺基水杨酸溶液完全冲洗到漏斗中;(3)用10 mL酒精和10 mL丙酮分别冲洗残渣2次。小心取下滤纸及残渣，折叠放置培养皿中，65℃烘干，移入称量瓶并称重。将残渣及滤纸105℃烘干，测定干物质。残渣及滤纸用凯氏定氮法，测定残留物的蛋白质含量。

计算干物质和蛋白质消化率，确定0.05 mol/L HCl－KCl缓冲液中胃蛋白酶的最适用量。

1.4.2.2 胰蛋白酶最适酶量的选择

准确称取5份0.5 g豆粕于250 mL培养三角瓶中，用得到的最适胃蛋白酶浓度的0.05 mol/L的HCl－KCl缓冲液溶液作前处理。以放入顺序取下三角瓶，用0.1 mol/L NaOH 溶液和0.1 mol/L的 HCl滴定消化液，使其 pH 6.8，量取 10 mL KH2PO4－NaOH缓冲液于三角瓶中，然后加入含不同胰蛋白酶活性条件(4、8、12、16、20 mg/mL 的 KH2PO4－ NaOH缓冲液配置)溶液各1 mL，继续培养3 h。

按1.4.2.1的方法测定胃蛋白－胰蛋白酶两步法得到残渣的干物质和蛋白质的含量。

计算干物质和蛋白质消化率，确定0.05 mol/L KH2PO4－NaOH缓冲液中胰蛋白酶的最适用量。

1.4.3 胃蛋白酶 － 胰蛋白酶两步法测定过程［17－20］

分别取5种粒度的豆粕及不同粒度豆粕配制的粉状配合饲料、颗粒料0.5 g于250 mL的培养三角瓶中，每种样品设3个重复，并作空白试验。使用最适浓度的胃蛋白酶和胰蛋白酶，参照1.4.1的方法测定不同样品的干物质和蛋白质含量，按下列公式计算干物质和蛋白质的消化率。

1.5 统计分析

试验数据采用 SAS 9.0软件进行分析，采用Duncan法多重比较，P ＜0.05者为差异显著。采用Orign8.0软件进行线性拟合并进行相关性分析作图。

2 结果与分析

2.1 饲料原料与粒度

生产上对于粉碎的程度一般用饲料粒度表示。饲料粉碎粒度就是指饲料或原料样品的平均颗粒大小［21］。选用 1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mm 筛孔孔径的筛片粉碎得到的原料及粉状配合饲料样品的粒度如表2所示。由表2可以看出:随着筛孔孔径从1.0 mm扩大到3.0 mm，豆粕粉碎样品的质量几何平均粒径增大(P＜0.05);粉状配合饲料的质量几何平均粒度随豆粕粒度的变化未表现出明显的变化规律:筛孔孔径超过2.5 mm，粉状配合饲料的粒度明显增大。筛孔孔径从1.0～2.0 mm，粒度变化不大(P ＞0.05)。

表2 粒度测定

王卫国等［22］对玉米和豆粕进行粉碎试验，结果显示粉碎筛片的筛孔孔径与同一种原料的粉碎物的质量几何平均粒径随筛孔减小而减小，且呈现一定的线性关系。本试验再次验证了筛孔孔径与粒度间的线性关系(P＜0.01)，但是筛孔孔径与粉状配合饲料粒度之间不存在规律性，出现这种情况原因可能与饲料中豆粕添加比例小有关。

2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶最适浓度

豆粕养分消化率与胃蛋白酶浓度、胰蛋白酶浓度关系见图1、图2。由图1、图2可以得出:胃蛋白酶最适浓度是70 mg/mL，胰蛋白酶最适浓度是16 mg/mL。

2.3 粒度与豆粕、粉状配合饲料及颗粒料消化率

2.3.1 粒度对豆粕、粉状配合饲料及颗粒料消化率的影响

对饲料粉碎的目的是增加饲料表面积，使胃肠内的消化酶与饲料充分接触，提高动物对饲料的消化率，提高饲料报酬。体外模拟消化方法除了受消化酶组成、剂量、pH和消化时间等影响外，还受饲料粒度的影响［23］。饲料原料粉碎粒度不同，直接影响其与消化酶的接触面积，进而影响消化率。对于颗粒饲料，原料粒度的不同会影响饲料的调质效果，影响颗粒饲料的质量，进一步影响消化率。王卫国［17］曾对5种不同粒度12/20目，40/60目，60/80目，80/100目(12/20目表示饲料通过12目筛，留存20目筛)的玉米、麸皮、豆粕、棉粕、菜粕分别进行体外消化试验研究，结果表明随粉碎粒度的增加消化率均有降低的趋势，但豆粕的变化幅度较小。第二年，其用小型锤片粉碎机在(4.5、2.5、2.0、1.0、0.6 mm)的筛片下进行粉碎，并利用胃蛋白酶－胰蛋白酶两步体外消化法测定不同粉碎物的蛋白质体外消化率得到同样的结果［22］。

本试验选用浓度为70 mg/mL的胃蛋白酶，16 mg/mL的胰蛋白酶分别测出不同粒度(432、505、637、717、805 μm)的豆粕，及以不同粒度基础加工的粉状配合饲料及颗粒料的干物质、蛋白质体外消化率。测定结果如表3。

表3 豆粕粒度与体外消化率

从表3中可同样得出豆粕体外DM、CP消化率随豆粕粉碎粒度的增加均呈现降低的趋势，但637、717、805 μm组间豆粕及颗粒料体外DM消化率差异不显著(P ＞0.05)。豆粕粒度从 432 μm 到 505 μm和从637 μm到717 μm对豆粕体外CP消化率影响均不显著(P ＞0.05)，这与李清晓等［24］的研究结果不一致，可能与选择的粒度范围和粉碎机粉碎方式不同有关;随豆粕粒度的增加，粉状配合饲料的体外DM、CP消化率未呈现明显的规律性，但637 μm组DM、CP体外消化率最高;对于颗粒饲料，豆粕粒度的变化对DM体外消化率影响不明显(P＞0.05)，但对颗粒料CP体外消化率影响明显(P＜0.05)，随粒度增加线性降低(P＜0.01)。比较粉状配合饲料和颗粒料的DM、CP消化率，很容易发现颗粒料的制作对于提高饲料消化率有明显的效果。

2.3.2 粒度与豆粕、粉状配合饲料及颗粒料消化率的线性分析

表4 豆粕粒度(X)与体外消化率(Y)的关系

对不同粉碎粒度的豆粕及配制的粉状配合饲料、颗粒料的体外消化率进行线性回归分析见表4。从表4中可以看出:本试验豆粕和颗粒料的体外消化率随豆粕粉碎粒度的变化呈直线相关关系，即随粒度的减小豆粕及颗粒料的消化率呈线性提高(图2)，但对于实际生产和饲喂而言，并非粒度越细越好。适当的粉碎粒度利于原料成分混合均匀，便于颗粒饲料的制作，提高制粒的效率和颗粒质量。但粒度过小会降低粉碎生产效率，且易造成物料流动不畅，甚至形成结拱，影响正常生产。对于仔鸡而言，粒度降低可通过增加与消化酶接触的表面积，改善营养素的消化率，但也有人认为粗颗粒会降低食糜通过肌胃的速率［25］，增加与消化酶的接触时间，从而改善能量利用率和营养素的消化率［26］，并且粒度过细蛋白质消化率提高不明显，反而可能会加重动物胃肠的角质化和损害。对直线相关关系进行显著性差异分析后，豆粕及颗粒料的消化率与粉碎粒度的关系为显著性直线正相关(P＜0.01)。不同粉碎粒度的豆粕配制的粉状配合饲料进行体外模拟消化，DM、CP消化率随豆粕粉碎粒度的变化未出现明显的线性规律(P=0.443、P=0.113)。这可能与豆粕在粉状配合饲料中添加比例小有关。

图3 粒度与消化率的关系

3 结论

随筛孔孔径的增大豆粕的粉碎粒度增大，并呈现一定的线性关系(P＜0.01)。豆粕粒度的变化对豆粕及颗粒料的体外消化率影响明显，综合考虑505 μm组和637 μm组均可得到较高的消化率，但考虑到粒度越小在粉碎过程耗费成本越大，认为637 mm为豆粕制作仔鸡颗粒料最适粉碎粒度，即2.0 mm为制作仔鸡颗粒料的筛片最佳筛孔孔径。

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