SSc-PF小鼠肺组织和外周血中Th2细胞水平、IL-10表达变化及意义

李 宇，张建全，钟小宁，雷 玲，谢佳峻

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

系统性硬化病(SSc)是一种病因不明，以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，可影响内脏包括心、肺和消化道器官的全身性疾病。其49．4%～90.0%的患者会出现肺纤维化(PF)，在各种结缔组织中发生率最高，也是病死率增加的一个重要原因［1］。目前，对SSc-PF起始和持续的发病机制仍未完全清楚，尚无有效措施预防或逆转疾病的进程。Th2细胞是重要的促纤维化细胞，以分泌IL-4、IL-10为特征，可促进成纤维细胞活化、增生，最终导致特发性PF形成［2］。2012年 5～12月，我们观察了SSc-PF小鼠肺组织及外周血Th2细胞水平和IL-10表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1．1 材料 实验动物:雌性 BALB/c小鼠30只，SPF级，6周龄，体质量20 g，由广西医科大学实验动物中心提供，正常饲养。药品与试剂:注射用盐酸博莱霉素(BLM，日本化药株式会社生产，批号491240，15 mg/支)，羟脯氨酸(HYP)测试盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，DNA纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(加拿大MBI Fermentas公司)，PCR试剂和引物(日本TaKaRa公司)。

1．2 方法

1．2．1 分组与造模 将小鼠分成3组，A组10只小鼠背部中央区皮下注射PBS作为对照，20只采用BLM皮下局部注射法［3］建立SSc模型，根据PF半定量评分将模型组分为B组(PF≥3分)11只和C组(PF＜3分)9只。

1．2．2 标本采集 小鼠通过眶后动脉放血处死，收集外周血1．0 mL，以4 000 r/min 离心 15 min，吸取上层血清，用于检测血清IL-10。用肝素抗凝管收集小鼠外周血1．5 mL，PBS重悬，用于分离得到外周血单个核细胞(PBMC)。剪下小鼠背部无毛皮肤并分成2份，一份用于检测羟脯氨酸(HPY)含量，一份投入10%中性甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋，制成4μm厚切片进行病理观察。打开小鼠胸腔，取出左肺上叶迅速移至－80℃冰箱保存，用于荧光定量PCR检测;左肺下叶分2份，一份用10%中性甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋，制成4μm厚的切片进行病理观察，另一份用于检测HYP的含量。右肺用于提取单个核细胞(MC)。

1．2．3 皮肤、肺部炎症及纤维化观察 皮肤及肺组织切片做Masson和HE染色，用病理图像分析仪系统软件测量皮肤厚度［4］。皮肤和肺部炎症评分:0分没有，1分少许，2分轻度，3分中度，4分重度。由2位病理科医生随机选取左下肺组织切片区域进行单独阅片，观察非重复的10个视野，放大200倍，进行Ashcroft半定量PF评分。

1．2．4 HYP测定 采用样本碱水解法，精确称取肺组织和皮肤50 mg放入试管中;加入水解液1 mL，混匀，95 ℃水浴 30 min，调整 pH 6．0 ～6．8;加入适量活性炭，充分混匀，离心，取1 mL进行检测;在波长550 nm处检测吸光度(A)值，然后换算成HYP含量(μg/mg)。

1．2．5 肺组织及外周血Th2细胞检测 取出右肺，根据参考文献［5］提取肺组织中的MC。PBMC采用Ficoll-泛影钠不连续密度梯度离心法分离得到。采用美国BD公司四色荧光流式细胞仪检测CD+4IL-4+Th2细胞，Cell Quest流式分析软件进行分析。

1．2．6 肺组织IL-10 mRNA检测 采用荧光定量PCR法。取小鼠左肺下叶肺组织100 mg，用Trizol法提取总RNA进行逆转录反应。胶回收纯化DNA片段作为标准品，β-肌动蛋白作为内参照，SYBR绿色Ⅰ核酸凝胶染料进行荧光定量PCR检测。各引物序列:β-肌动蛋白上游引物为 5'-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3'，下游引物为5'-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3'，扩增产物 200 bp;反应条件:94 ℃ 20 s，57．5 ℃ 30 s，72 ℃ 31 s，40 个循环;IL-10上游引物为5'-CCATGGCCCAGAAATCAAGG-3'，下游引物为5'-TCTTCACCTGCTCCACTGCC-3'，扩增产物129 bp;反应条件:95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。采用标准曲线法计算mRNA相对表达量，将IL-10 mRNA与β-肌动蛋白mRNA相对表达量的比值为其mRNA表达量校正值，经均一化处理后得出其相对量。所有样本均设置3个复孔。

1．2．7 外周血IL-10检测 采用ELISA法，操作按试剂盒说明书进行。

1．2．8 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。正态分布的计量资料用¯x±s表示，组间比较采用方差、秩和和t检验分析;相关性检验用Spearman相关分析法。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 皮肤和肺组织病理观察 A组小鼠背部注射部位皮肤和肺组织结构完整，无明显的炎症细胞浸润和胶原纤维增生;B、C组小鼠皮肤明显增厚，胶原纤维明显增生，附属器萎缩及大量炎症细胞浸润;见插页Ⅰ图2。B组肺部结构明显破坏，可见大量淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，并且有肺泡、肺间质及支气管壁中度以上纤维性增厚或者有纤维束的形成;C组肺部结构无明显破坏，肺泡、肺间质及支气管壁无或仅有少量纤维性增厚。各组小鼠皮肤、肺部病理及HYP水平比较，见表1。

表1 各组小鼠皮肤、肺部病理及HYP水平比较±s)

表1 各组小鼠皮肤、肺部病理及HYP水平比较±s)

注:与 A 组比较，*P ＜0．01;与 C 组比较，#P ＜0．01

组别 n 皮肤厚度(μm)炎症评分(分)HYP(μg/mg)皮肤 肺部A 组 10 40．77 ±12．66 0．40 ±0．52 0．40 ±0．52 0．60 ±0．7皮肤 肺部PF评分(分)0 1．45 ±0．40 0．38 ±0．16 B 组 11 97．87 ±22．02* 2．82 ±0．75* 2．36 ±0．81*# 4．00 ±1．41*# 3．07 ±1．26* 0．64 ±0．08*#C 组 9 91．73 ±15．33* 2．44 ±0．73* 1．33 ±0．50* 1．50 ±0．76* 2．43 ±0．61*0．45 ±0．08

2．2 各组小鼠外周血、肺组织中Th2细胞比例和IL-10水平比较 见表2。

表2 各组小鼠外周血、肺组织中Th2细胞比例和 IL-10 水平比较( ±s)

表2 各组小鼠外周血、肺组织中Th2细胞比例和 IL-10 水平比较( ±s)

注:与 A 组比较，*P ＜0．05，#P ＜0．01;与 C 组比较△P ＜0．05，▽ P ＜0．01

组别 Th2细胞(%)肺组织IL-10外周血 肺组织外周血IL-10(pg/mL)mRNA A组9．90 ±7．42 7．40 ±4．93 76．82 ±25．74 8．60 ±6．88 B 组 23．23 ±5．32＊△ 23．50 ±5．40#△ 126．77 ±42．78#▽ 21．36 ±7．88#C 组 12．28 ±7．10 14．72 ±6．81 76．56 ±27．74 16．00 ±6．56*

2．3 各指标的相关关系 PF、肺部炎症评分与皮肤厚度、炎症评分呈正相关(r分别为0．687、0．791，P均＜0．05)，外周血、肺部Th2细胞与肺部炎症、HYP、PF 评分呈正相关(r分别为 0．586、0．535、0．595和0．538、0．423、0．581，P 均 ＜ 0．05)。IL-10 mRNA在肺组织的表达量与肺部炎症、HYP、PF评分呈正相关(r分别为 0．532、0．460、0．474，P 均 ＜0．05)，血清IL-10水平与肺部炎症、HYP、PF评分呈正相关(r分别为 0．387、0．461、0．410，P 均 ＜0．05)。肺部Th2细胞与肺部IL-10 mRNA、外周血IL-10 水平呈正相关(r分别为 0．517、0．363，P 均 ＜0．05)，外周血Th2细胞与肺部IL-10 mRNA呈正相关(r=0．444，P ＜0．05)。

3 讨论

小鼠背部皮下局部注射BLM，导致小鼠局部皮肤硬化并出现PF，产生自身抗体，且组织纤维化和自身抗体的产生与CD+4T细胞激活有关，这一模型很好地模拟了人类SSc-PF的主要特征［3］。本研究使用BLM在小鼠背部皮肤局部注射，与对照组比较，B、C组小鼠皮肤明显增厚，HYP、皮肤炎症明显增多;且B组小鼠出现肺部结构明显破坏，肺泡、肺间质和支气管壁纤维不同程度增厚，肺部炎症和纤维化评分、HYP较A、C组明显增多。提示造模后小鼠皮肤和肺部出现炎症与纤维化病变特征，成功再现了SSc继发性PF的模型。随着皮肤厚度和炎症加重，肺部炎症和纤维化程度也越来越重。

PF是由多种病因引起的慢性、间歇性和广泛的肺部疾病，其主要病理特点是弥漫性肺泡炎，肺间质纤维细胞增殖，大量细胞外基质积聚，肺泡结构紊乱和PF［6］。T细胞在PF发病机制中起到重要作用。一些研究表明，Th2细胞及其细胞因子对于PF起主要调节作用。Th2细胞及其细胞因子促进肺、皮肤等多种器官的纤维母细胞滋生和细胞外基质产生，加强胶原蛋白、纤连蛋白及肌腱蛋白的合成等［2］;此外，IL-4还是成纤维母细胞强有力的趋化因子。有实验表明，抗氧化转录因子Nrf2通过调节肺氧化水平和转移Th1/Th2细胞间的平衡诱导Th1细胞反应，可以防止BLM致PF［7］。本研究发显示，与A组比较，B组小鼠外周血和肺部CD+4IL-4+Th2细胞数明显增多，且与肺部炎症评分、肺部HYP含量呈正相关，提示Th2细胞参与SSc-PF的发病，可能在PF病变中起促进作用。另外，有研究显示Th2细胞通过促进成纤维细胞活化、增生，使胶原蛋白合成增加，并且能够抑制其降解，导致基质蛋白沉积和纤维组织生成，最终形成纤维化［7］。

本研究显示，B、C组小鼠肺部IL-10 mRNA和B组外周血IL-10水平较A组明显增高，且肺部IL-10 mRNA表达量、血清IL-10水平与肺部炎症与纤维化评分、肺部 HYP 显著正相关。Barbarin 等［8，9］在PF小鼠模型中发现过度表达的IL-10可加重肺纤维化，且IL-10通过激活Th2型细胞因子，增加IL-4、IL-13等表达，促进PF形成［10］。动物实验研究也证实，IL-10可能通过CCL2/CCR2轴促使纤维细胞聚集和巨噬细胞活化最终导致PF［11］。最近研究表明，IL-10 主要通过上调 TGF-β1、IL-4、IL-13 等表达参与PF发病，这些都提示IL-10在SSc-PF中扮演重要角色。在Th0细胞分化过程中，IL-10可抑制Th0细胞向Th1细胞分化，诱导其向Th2细胞分化，且Th2也能产生IL-10。本研究发现，Th2与IL-10呈正相关，推测IL-10的增高可能与Th2增高有关，两者在SSc-PF发病中可能起促进作用。

总之，Th2细胞和IL-10在SSc-PF小鼠模型外周血、肺组织表达增高，且与肺部炎症和纤维化呈正相关，两者可能促进SSc-PF发病，抑制Th2细胞及其相关的细胞因子将有可能成为未来治疗SSc-PF的靶点。

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