榄香烯乳对乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7凋亡的影响

殷玉琨，宋爱莉，孙子渊

(1山东中医药大学，济南250014;2山东中医药大学附属医院)

乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤的首位，且不断上升，并有年轻化趋势，严重危害妇女健康。虽然近年来其治疗已取得长足进展，但一些恶性程度较高的类型及复发转移的晚期患者预后较差。其中三阴性乳腺癌发病率约占乳腺癌所有类型发病率的17．27%［1］，且由于其生物学特性，对内分泌治疗不敏感［2］。寻找有效的治疗药物是目前研究的热点之一。榄香烯乳系中药莪术提取物，是我国具有独立产权的抗癌新药，对肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌和妇科肿瘤等多种恶性肿瘤的体内、外增殖具有抑制作用［3，4］，并可以增强临床多种抗癌药物的疗效，降低放化疗的毒副反应［5，6］;临床上主要用于介入、腔内化疗及癌性胸腹水的治疗［7，8］，具有良好的应用前景。但目前关于榄香烯乳作用于乳腺癌的效果及机制的研究较少。我们既往研究表明，莪术油(其主要抗肿瘤成分为榄香烯乳)可以降低乳腺癌及癌前病变造模大鼠成瘤率、肿瘤组织血管生成，促进肿瘤细胞凋亡等［9，10］。2012年7 月 ～2013 年 1 月，我们在既往研究的基础上，观察榄香烯乳对乳腺癌细胞株生长及凋亡的影响，以探索榄香烯乳抗乳腺癌的机制。

1 材料与方法

1．1 材料 选用 ER、PR、HER-2均阴性的高侵袭乳腺癌细胞系MDA-MB-231及ER阳性、PR阳性、HER-2阴性的低侵袭乳腺癌细胞系MCF-7(英国卡迪夫大学外科系实验室惠赠)。榄香烯乳注射液(100 mg/20 mL)购自大连华立金港药业有限公司(批号:1207161)，胎牛血清和DMEM/Ham's F12购自PAA Laboratories公司，Tri-reagent试剂、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及GAPDH 的Q-PCR引物均购自Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 MDA-MB-231及MCF-7细胞系的培养 用含10%胎牛血清和DMEM/Ham's F12培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养细胞，选用对数生长期细胞进行实验。

1．2．2 结晶紫法检测细胞生长速率［11］将对数生长期的MDA-MB-231及MCF-7细胞接种于96孔板，每孔种2 000个细胞(200μL)，每组重复5孔，重复3板，分别标记“0 h”、“48 h”和“96 h”。分别设空白对照组，及不同浓度的榄香烯乳处理组。空白对照组加入榄香烯乳的普通培养基，榄香烯乳处理组分别加入终浓度含10、20、40、80、160 μg/mL 的榄香烯乳注射液的培养基。放入孵育箱培养(37℃、5%CO2、饱和湿度)，于种植后第 1 天(0 h)、第3天(48 h)、第4天(96 h)分别取出，去掉培养液，加入4%甲醛固定过夜，0．5%结晶紫染色10 min后冲洗晾干，10%醋酸溶液溶解后，置于540 nm分光光度计(BIO-TEK，ELx800)读取吸光值(OD值)。细胞生长速率表示为(OD48h或 OD96h－OD0h)/OD0h×100%。细胞抑制率表示为(1－OD处理组/OD对照组)×100%。实验重复3次。应用药物浓度计算软件(LOGIT法)计算中位抑制浓度(IC50)。

1．2．3 RNA提取及cDNA逆转录［12］标记培养瓶MDA-MB-231或 MCF-7空白对照、榄香烯乳处理组，分别种植对数生长期的细胞1×106于培养瓶中，加入普通培养基孵育过夜(37℃、5%CO2、饱和湿度)。待细胞贴壁后，分别换入新鲜普通培养基或含40μg/mL榄香烯乳的培养基，培养48 h，显微镜下拍照记录细胞形态。Tri-reagent试剂提取细胞RNA，质量检测后，逆转录获取cDNA。

1．2．4 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 检测 采用Q-PCR法［13］。分别取榄香烯乳处理后的及空白对照的MDA-MB-231细胞的cDNA，分别制备Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 及 GAPDH 的 Q-PCR 反应液，应用 Icycler IQ5 system(Bio-Rad，Hammel Hemstead，UK)Real-time PCR系统获取不同组间的Caspase及内参GAPDH的表达值。引物序列如下:Caspase-3正向引物为5'-GGCGTGTCATAAAATACCAG-3'，反向引物为5'-ACTGAACCTGACCGTACAACAAAGCGACTGGATGAA-3';Caspase-8正向引物为5'-AGAAAGGAGGAGATGGAAAG-3'，反 向 引 物 为5'-ACTGAACCTGACCGTACAGACCTCAATTCTGATCTGCT-3';Caspase-9正向引物为5'-AAGCCCAAGCTCTTTTTC-3'，反向引物为5'-ACTGAACCTGACCGTACAGTTACTGCCAGGGGACTC-3';GAPDH正向引物为5'-CTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，反向引物为5'-ACTGAACCTGACCGTACACAGAGATGACCCTTTG-3'。反应条件如下:95℃15 min预变性，然后按95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(共60个循环)，最后72℃10 min延伸。反应结束后确认Real-time PCR的扩增曲线和融解曲线，并对结果进行分析:相对定量=目的基因的表达×内参基因表达的修正比值。

1．2．5 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。所有实验均重复3次以上，实验结果采用¯x±s表示，计量资料的组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 榄香烯乳对细胞生长速率的影响 分别用不同终浓度的榄香烯乳处理细胞48、96 h后，与对照组(0μg/mL)比较，榄香烯乳浓度达到一定剂量时，细胞的生长速率明显下降，且呈时间—剂量依赖性。48 h时对MDA-MB-231细胞的IC50为58μg/mL，对MCF-7细胞的IC50为148μg/mL。见表1。

2．2 榄香烯乳对细胞形态的影响 终浓度为40 μg/mL的榄香烯乳培养基处理 MDA-MB-231和MCF-7细胞48 h后，与对照组比较，应用榄香烯乳的细胞由黏附状态变圆，细胞核固缩、崩解，可见凋亡小体，呈现典型的细胞凋亡表现。见插页Ⅰ图1。2．3 榄香烯乳对MDA-MB-231细胞Caspase表达的影响 空白对照组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表达量(×107拷贝量)分别为56．7 ±15．7、140．3±25．6、13．1 ±4．4，经榄香烯乳处理后分别为812．2±222．6、327．8 ±50．1、5．7 ±1．5，与空白对照组比较，经榄香烯乳处理后Caspase-3、Caspase-8表达量升高(P均＜0．05)，Caspase-9表达量无明显变化(P＞0．05)。

表1 榄香烯乳对细胞生长速率的影响(%±s)

表1 榄香烯乳对细胞生长速率的影响(%±s)

注:与0 μg/mL 比较，*P ＜0．05，△P ＜0．01

榄香烯乳MDA-MB-231 MCF-7 48 h 96 h 0μ 48 h 96 h g/mL 252±13 641±11 404±50 1 022±111 10μg/mL 271± 9 624±29 451±64 1 178±100 20μg/mL 254± 9 540±29* 435±54 1 200± 96 40μg/mL 214±15 557±17△ 400±33 1 074± 51 80μg/mL 48±12△ 160±27△ 326±41 897± 69 160μg/mL －25± 5△ －45± 6△ 181±34* 277±137△

3 讨论

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，目前以手术、化疗、放疗的综合治疗为主，但仍有复发转移的治疗失败者，尤其三阴性乳腺癌对内分泌治疗不敏感，且目前缺乏相应的靶向治疗药物。榄香烯乳作为Ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤药，具有化疗增敏、逆转肿瘤多药耐药和提高机体免疫功能等多重作用，且不良反应较轻，因而在乳腺癌的临床治疗上有良好的应用前景。经文献检索，既往已进行了榄香烯乳对多种恶性肿瘤的体内及体外实验，但针对榄香烯乳治疗三阴性乳腺癌的效果及机制的报道较少。

既往研究证明，榄香烯乳可抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡是其主要的途径之一。本研究选择ER阳性、PR阳性、Her-2阴性的低侵袭性细胞株MCF-7及ER、PR、Her-2均阴性的高侵袭性细胞株MDA-MB-231，采用榄香烯乳进行干预观察其对MDA-MB-231细胞生长速率及凋亡诱导的影响。实验结果表明，当榄香烯乳达到一定浓度时，可抑制乳腺癌细胞的生长，且呈浓度依赖性;相对于低侵袭性的MCF-7细胞系，对高侵袭性MDA-MB-231细胞系的抑制作用更为明显;经过榄香烯乳处理后，两种细胞系均呈现出细胞凋亡的形态特征;针对榄香烯乳作用后的MDA-MB-231细胞凋亡因子的检测显示，榄香烯乳可能是通过诱导了乳腺癌细胞的凋亡从而达到抑制其生长的作用。

细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，是一种受遗传学机制调控的为维持内环境稳定的细胞自杀过程。现代肿瘤学认为，逃避免疫监视是肿瘤发生与发展的重要机制之一。随着对肿瘤细胞凋亡研究的深入，科研人员发现细胞凋亡在肿瘤免疫逃逸中起着重要作用。越来越多的实验证实，Caspases在细胞凋亡调节过程中起关键作用［14］。细胞凋亡受到严格调控，在正常细胞Caspase处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦开始，Caspase被激活，随后凋亡蛋白酶的层叠级联反应以不可逆的形式发生。目前，已经发现 Caspase家族至少有14个成员，其中Caspase-2、8、9、10、11 主要负责对执行者的前体进行切割，从而产生有活性的执行者;Caspase-3、6、7主要负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白。细胞凋亡的途径有死亡受体路径、线粒体路径等。在死亡受体路径中，Caspase-2、8被激活，最终激活其效应器酶(通常Caspase-3)而导致细胞死亡［15］;在线粒体路径中，Caspase-9被激活，然后激活下游的效应 Caspase 如 Caspase-2、3、6、7、8、10，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡［16］。本研究中，经榄香烯乳处理后的 MDA-MB-231细胞Caspase-3、Caspase-8上调，而Caspase-9与对照组比较无统计学差异，提示榄香烯乳诱导的乳腺癌细胞凋亡，可能是通过死亡受体路径引起的。

综上所述，榄香烯乳抑制乳腺癌细胞的生长速率，其可能机制是通过激活死亡受体途径诱导了细胞的凋亡。本次实验结果为后续研究提供了良好的前期基础，同时也为临床选择三阴性乳腺癌治疗方案提供了一些思路及实验支持。

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