玫烟色棒束孢与短期35℃高温对小菜蛾3龄幼虫的联合作用

张 伟，吕利华，何余容*，念晓歌

(1.华南农业大学资源环境学院，广州 510642;2.广东省农业科学院植物保护研究所，广州 510640)

小菜蛾Plutella xylostella 是世界性的十字花科蔬菜重要害虫，隶属鳞翅目Lepidoptera，菜蛾科Plutellidae，在热带和亚热带地区危害猖獗(刘青娥和夏更寿，2005)。目前对小菜蛾的防治仍以化学防治为主，然而长期使用广谱性杀虫剂，不但杀伤天敌、削弱生态系统的自然控制作用，而且导致小菜蛾产生抗药性(吴敏等，2005)，应用新型生物农药防治小菜蛾已成为必然的趋势(Weinberger and Srinivasan，2009;Grzywacz et al.，2010)。

玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea，原名玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosorseus，是重要的虫生真菌，能寄生同翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等多种有害昆虫。上世纪80年代后期，美国加里佛尼亚大学与W.R.Grace 公司合作研制出玫烟色棒束孢PF97 菌株制剂，用于防治Bemisia argentifolii;此后荷兰的Bilcon和Biobest，墨西哥的Pae－sin和委内瑞拉的Bemisin 以及美国和欧洲研制的芽生孢子与菌丝体的混合制剂PreFeRal 相继问世(Hallsworth and Magan，1995;Hallsworth and Magan，1996)。

以往的研究表明，当前小菜蛾的防治药剂多数为正温度系数药剂，即高温条件下，农药对小菜蛾的毒力或药效会提高(李慧冬和罗万春，2004;魏雪生等，2003;陈焕瑜等，1999;冯惠玲和黄彰欣，1997)。这些结果只反映了农药毒力或药效测定时的高温影响，有关农药使用前后短期高温对农药毒力或药效影响的研究尚较少。自20世纪90年代以来，不利刺激对生物的低剂量兴奋(Hormesis)效应再度受到关注。Hormesis 指各类不利刺激对生物体在高剂量时表现负面影响，但在低剂量时却表现为有益作用的现象(Chapman，2001)。

温度对玫烟色棒束孢菌丝生长、产孢及孢子萌发等都有很大影响，因而直接影响到菌株的致病力(景云飞和张仙红，2007)。本研究试图通过研究短期高温与玫烟色棒束孢对小菜蛾3龄幼虫的联合作用，为了解短暂高温对玫烟色棒束孢毒力的影响提供资料，进而为完善小菜蛾生物防治策略提供依据。同时初步探讨新型微生物农药联合作用评价中采用的协同毒力指数(Cooperative virulence index，c.f.)应用于Hormesis 效应评价的可行性。

1 材料与方法

1.1 供试虫源与寄主植物

2011年10月于华南农业大学试验农场的十字花科蔬菜地采集小菜蛾老熟幼虫，在实验室内用芥蓝Brassica albograbra Bailey 苗饲养至化蛹，待其羽化产卵后建立小菜蛾实验室品系，作为供试虫源。

小菜蛾的饲养:室内采用营养钵芥蓝苗法饲养小菜蛾。在营养钵中加入营养土，将种子均匀播散在其中，并覆盖上一薄层土壤。将苗盘放在(25±1)℃下，待种子萌发后放于室外自然光照条件下培养，待芥蓝苗长到4 cm 左右时，将菜苗放入有小菜蛾蛹和新羽化成虫的产卵笼(100 cm×50 cm×40 cm)内。养虫笼顶放有10 %蜂蜜糖水棉球，供成虫补充营养。根据成虫产卵情况更换芥蓝苗，一般12 或24 h 更换一次。将更换的带虫卵的芥蓝苗移至室内养虫架饲养，当芥蓝苗快被幼虫吃光时，将幼虫转接到新鲜芥蓝苗上。老熟幼虫化蛹后，收集蛹作为继代繁殖的虫源。饲养条件为(25±1)℃，相对湿度65 %～75 %，光周期14L∶10D(吕利华等，2007)。

1.2 供试菌株和孢子悬浮液的配制

玫烟色棒束孢最初分离自家白蚁Coptotermes formosanus，菌株编号为SCAU－IFCF01，在华南农业大学昆虫生态室以甘油保存法保存于－80℃超低温冰箱中。实验前取出菌种，在无菌条件下接种于PDA 斜面进行活化培养10 d，并保存于4℃的冰箱中。以接菌后的PDA 平板在25℃恒温光照(14 L∶10 D)培养箱中培养14 d，待菌丝长满培养皿后加入20mL 0.03 %吐温－80 无菌水，用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子，将菌液倒入烧杯中，用磁力搅拌器搅拌30 min。待孢子完全分散后，用双层医用纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液，弃去杂质和培养基残物。用血球计数器计数母液的孢子浓度，用0.03 %吐温－80 的无菌水配成3个供试浓度(低、中、高):1×105、1×106和1×107个孢子/mL。

1.3 试验处理

1.3.1 高温水平及持续时间设定

高温处理在人工气候培养箱中进行(RXZ 智能型人工气候箱，精度±1℃，宁波江南仪器厂)，参考McClarchie ＆ Moore高温水平设定为35℃，持续时间为0 h、2 h、4 h、8 h。

1.3.2 玫烟色棒束孢菌液预处理后短期35℃高温处理

选取龄期一致的3龄初小菜蛾幼虫，浸渍于玫烟色棒束孢浓度为1×105、1×106和1×107个孢子/mL 的孢子悬浮液中10 s，然后放在干净的滤纸上以吸去多余的水分。在直径为11 cm 的灭菌培养皿内放入1 张滴有少量无菌水的滤纸，上并在滤纸上放置1片干净无虫伤的芥蓝叶片，然后将20头经幼虫接在芥蓝叶片上，并用扎有小孔的保鲜膜将培养皿封好，然后移至设定温度下处理不同时间，将处理后的小菜蛾移至正常条件下(温度:25±1℃，相对湿度65 %～75 %，光周期:14L:10D，下同)饲养，并及时更换新鲜的芥蓝叶片。48 h 后统计试虫死亡数，计算死亡率，每处理重复5次。

1.3.3 短期35℃高温预处理后玫烟色棒束孢菌液处理

在直径11 cm 的灭菌培养皿内放入1 张滴有少量无菌水的滤纸，并在滤纸上放置1片干净无虫伤的芥蓝叶片，然后将20头龄期一致的3龄初小菜蛾幼虫接在芥蓝叶片上，并用扎有小孔的保鲜膜将培养皿封好，移至设定温度下处理不同时间。取出后分别浸渍于玫烟色棒束孢浓度为1×105、1×106和1×107个孢子/mL 的孢子悬浮液中10 s，然后放在干净的滤纸上将多余水分吸干。再将处理后的幼虫放在灭菌培养皿内中干净无虫伤芥蓝叶片上，皿底放有1 张滴有少量无菌水的滤纸用以保持湿度，并用扎有小孔的保鲜膜将培养皿封好，放至正常条件下饲养，及时更换新鲜的芥蓝叶片。48 h 后统计试虫死亡数，计算死亡率，每处理重复5次。

1.4 数据分析

采用DPS 及Excel 2003 作为统计工具，用新复极差法检验不同处理间的差异显著性，显著水平设置为P=0.05。

协同毒力指数=(实际死亡率－理论死亡率)/ 理论死亡率×100。协同毒力指数≥20，为协同作用;≤－20，为拮抗作用;介于二者之间为相加作用(姚湘江，1983)。

2 结果与分析

2.1 短期35℃高温对试虫的影响

由表1 知:当玫烟色棒束孢处理浓度为0 时，试虫经35℃高温短期处理后，死亡率都低于10%。CK 的死亡率为2 %，但各处理间及与对照没有明显差异(P＞0.05)，说明短期35℃高温处理在所设定的时间梯度下，对试虫影响不明显。

2.2 玫烟色棒束孢菌液与短期35℃高温对小菜蛾的联合作用

试虫对玫烟色棒束孢的敏感性，表现在处理后试虫死亡率与未经处理的试虫死亡率存在差异，其变化形式及程度与玫烟色棒束孢的孢子浓度及35℃高温处理时间有关。

在玫烟色棒束孢孢子浓度为1×105个孢子/mL预处理条件下，随着短期高温处理时间的增加，试虫的死亡率呈下降趋势，但差异不显著(P＞0.05);而在其浓度为1×106和1×107个孢子/mL预处理条件下，随着短期高温处理时间的增加，试虫死亡率呈现先下降后上升的趋势，但都较只经菌液处理的试虫死亡率低，在高温处理4 h 时，两种浓度处理条件下，试虫的死亡率均分别显著低于只经同种菌液浓度处理后试虫的死亡率(P＜0.05)见图1。在三种供试菌液浓度处理条件下试虫的死亡率均较其相同浓度预处理后再经高温处理的试虫死亡率高，表明短期35℃高温对本菌株菌液的毒力有抑制作用。

由图2 可知，经35℃短期高温预处理2 h，再分别用三种不同浓度的玫烟色棒束孢菌液处理后，试虫的死亡率都较只经相对应浓度的菌液处理后试虫的死亡率低;然而在相同处理情况下，经35℃短期高温预处理4 h和8 h 后，试虫的死亡率均较只经同种浓度下玫烟色棒束孢菌液处理的试虫死亡率高，且当高温预处理8 h 时，三种浓度菌液处理后试虫的死亡率均分别显著高于同种浓度菌液但未经高温预处理的试虫的死亡率(P＜0.05)。上述结果表明，短期35℃高温预处理2 h对试虫具有保护作用，而预处理4 h和8 h 则对试虫表现出不利影响。

短期35℃高温对玫烟色棒束孢预处理毒力的影响可以由协同毒力指数更清楚地看出(表1)，当35℃高温处理2 h和4 h 时，玫烟色棒束孢低、中和高浓度菌液处理试虫后，联合毒力均表现出拮抗作用，这可能是因为高温在本菌株孢子附着于试虫体壁以及侵染试虫过程期间降低了其活力，从而表现出拮抗作用;当35℃高温处理8 h 时，再经玫烟色棒束孢低浓度菌液处理试虫后，其联合毒力仍表现为拮抗作用，造成此种结果的原因同上述分析。但是对中、高浓度菌液的毒力则表现为相加作用，这可能是因为在中、高浓度条件下，菌液孢子数量较多，持续8 h 的短期高温降低了部分孢子的活力，与此同时还影响了试虫的生理生化代谢特性，为有活力的孢子侵染试虫提供了较有利的环境，从而表现出相加作用。

表2 表明了玫烟色棒束孢与短期35℃高温预处理对小菜蛾的联合毒力作用，当35℃高温预处理2 h，再经低浓度菌液处理后，其协同毒力指数小于－20，表现为拮抗作用，可能是因为短期的高温刺激使试虫产生抵抗外界不利侵害的能力，从而使得孢子不易侵害试虫，对试虫具有较好的保护作用;而中、高浓度菌液条件下，则表现为相加作用，可能是在中、高浓度的孢子侵害环境下，保护作用不足以抵抗孢子的侵害能力;当35℃高温预处理4 h 时，三种菌液浓度处理试虫，根据联合毒力指数所反映的结果均表现为相加作用，这也可能是保护作用不足以抵抗孢子的侵害能力;当35℃高温处理8 h 时，低、中浓度菌液对试虫的毒力表现为相加作用，而高浓度菌液对试虫的毒力则表现为协同作用，这可能是在8 h 高温处理条件下，试虫的生理生化正常的调节机制受到破坏，从而为本菌株孢子的侵害创造了有利的环境，使得试虫的死亡率增加。

表1 玫烟色棒束孢预处理与短期35℃高温的联合作用评价Table 1 Interaction assessment between Isaria fumosorosea pretreatment and short－term heat at 35℃

表2 短期35℃高温预处理与玫烟色棒束孢菌液的联合作用评价Table 2 Interaction assessment between short－term heat pretreatment at 35℃and Isaria fumosorosea

(续上表)

3 结论与讨论

本研究根据广东地区夏季高温实际情况，设定短期35℃高温与虫生真菌玫烟色棒束孢对小菜蛾进行联合作用评定。长期高温对小菜蛾的生长发育及存活具有不利影响，但是短期的高温处理对其生长发育及存活的影响却不尽如此。

玫烟色棒束孢菌液预处理，再经35℃短期高温处理不同时间条件下，试虫的死亡率均低于其相应菌液处理条件下试虫的死亡率，表明短期35℃高温对该菌侵染试虫，进而发挥其毒力作用具有负面影响。有文献报道，在35℃短期高温处理0～60 min 条件下，高温对白僵菌孢子的萌发和生长基本无影响(农向群等，1999);在35℃短期高温处理条件下，对球孢白僵菌的孢子萌发和生长基本无影响，当环境温度高于35℃，球孢白僵菌的孢子萌发和生长均受抑制(McClarchie and Moore，1994;Iskandarov et al.，2006);也有相关文献报道白僵菌关于侵染的温度上限是35℃，高温将降低其侵染活力(张志光，1987);玫烟色棒束孢部分菌株在35℃条件下，其产孢量和孢子活力明显下降(郑武和冯明光，2007)。本文研究结果表明，35℃短期高温处理对玫烟色棒束孢SCAU－IFCF01 菌株对小菜蛾3龄幼虫的毒力有较明显的降低作用。

有研究表明在8～30℃范围内，小菜蛾存活率大致随着温度的升高而增大，当温度超过30℃后，存活率随着温度的上升而减小，特别是在35℃时，存活率急剧下降，从整个世代来看，世代存活率与温度之间呈明显的抛物线相关，25℃时小菜蛾的世代存活率最高(但建国等，1995)，在15～30℃恒温范围内初孵幼虫－成虫羽化时存活率最高，32.5℃时存活率急剧下降，35℃时存活率几乎为0(Shirai，2000);当35℃高温预处理2 h 或4 h，对小菜蛾3龄幼虫保护作用较强，能够降低氟虫腈毒力，但持续时间为8 h，则会提高氟虫腈的毒力(顾晓军等，2009);35℃高温预处理2 h，与阿维菌素的联合作用表现为相加作用，4 h 对1.13和2.25 mg/L 的阿维菌素毒力有拮抗作用，对其他的浓度毒力表现为相加作用，8 h 对0.28，1.13和2.25 mg/L 的阿维菌素毒力有协同作用，对其他浓度则表现为相加作用(田素芬等，2008)。本研究结果表明，当35℃高温预处理2 h时，玫烟色棒束孢菌液对小菜蛾3龄幼虫的毒力有所下降，具有保护作用;当高温持续至4 h和8 h时，该菌液的毒力有所增强，这可能是由于持续高温导致昆虫通过生理生化调节机能，高温使昆虫表皮的蜡质层瓦解，油脂融化，表皮渗透性增加，虫体大量失水，使得该菌较易侵染，从而导致死亡率升高(Henry and Prange，1996;Gibbs，2002;Yoder and Denlinger，1991)。

Hormesis 效应的影响通常较小，一般在30%～60%之间，少数达到2倍(Calabrese，2003)，研究中多采用显著性检验比较数据之间的差异，然而Hormesis 效应如此低的影响通常不能通过检验，这也是Hormesis 效应及其意义至今仍受质疑的原因。本文采用短期高温和玫烟色棒束孢菌液不同处理顺序相结合的研究思路，考察两者前后处理条件下对小菜蛾的毒力情况，将为田间科学防治小菜蛾提供重要的理论指导。本研究表明，试虫经玫烟色棒束孢菌液预处理后，在短期高温处理下，其对试虫的毒力有所下降;而短期高温预处理对于该菌株菌液对试虫的毒力既有降低也有增强的作用。关于这两种不同处理条件下，两者对小菜蛾的联合作用机制还有待于进一步研究。

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