昆虫病原线虫对二点委夜蛾致病力的研究

雷利平，南宫自艳，李立涛，董志平，王勤英*

(1.河北农业大学植保学院，河北保定 071000;2.河北省农林科学院谷子研究所，河北石家庄 050035)

二点委夜蛾Athetis lepigone Möschler属鳞翅目夜蛾科，主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯和欧洲等地(姜京宇等，2008)。2011年二点委夜蛾在我国夏玉米产区7个省市暴发，并造成缺苗断垄和一定面积的毁种补苗，危害性极强(王振营等，2012)。二点委夜蛾幼虫喜欢隐蔽和潮湿的麦秸和麦糠堆下，其幼虫主要在夏玉米苗期造成危害，特别是3～5 叶期的玉米受害最重;幼虫主要集中在寄主作物根基部为害，咬食根基部幼嫩组织，或在茎基蛀茎为害，导致幼苗死亡，严重为害时常造成补种或毁种现象(江幸福等，2011)。由于近年来很多地区麦收时推广秸秆还田的耕作方式，小麦收获后将麦秸和麦糠直接覆盖在田间，给二点委夜蛾创造了很好的栖息环境，再加上该种害虫喜欢在麦秸等覆盖物下隐蔽为害，喷施化学农药和撒毒土等防治方法均因为覆盖物遮挡的原因效果不佳(王振营等，2012)。

昆虫病原线虫有可能被用来防治二点委夜蛾。昆虫病原线虫目前应用最多的是斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis，它们肠道内分别携带有致病杆菌Xenorhabdus和发光杆菌Photorhabdus，与之形成共生关系。昆虫病原线虫侵染期幼虫通过昆虫口腔、肛门和气门等自然开口或直接由表皮侵入昆虫体内，在昆虫血腔中释放出共生菌，快速增殖并产生毒素，造成寄主患败血症死亡(Herbert and Goodrich-Blair，2007)。昆虫病原线虫具有主动寻找寄主昆虫、专一性强和对环境安全等特点，特别是昆虫病原线虫在土壤中有较好的生存能力和扩散能力，对隐蔽性害虫如地下害虫、钻蛀害虫有着其它防治手段不可比拟的优势(Hazir et al.，2003)。为了探索利用昆虫病原线虫防治二点委夜蛾的可行性，本文通过室内生物测定，筛选对二点委夜蛾幼虫高致病力的昆虫病原线虫，明确其最佳的侵染条件，为生产上应用昆虫病原线虫防治二点委夜蛾提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试线虫

供试线虫有Heterorhabditis bacteriophora HB8、H.bacteriophora HB140、Steinernema.carpocapsae NJ、S.carpocapsae HB310、S.lonqicaudum CW105和S.glaseri NC 均来自河北农业大学害虫生物防治实验室。选取的昆虫病原线虫在生测前均用大蜡螟进行活体扩繁，已保证较高的侵染活性(Malan et al.，2011)。

1.1.2 供试昆虫

二点委夜蛾为河北农业大学害虫生防实验室饲养。在室内温度为(25±1)℃，湿度(≥70%)光暗比(16∶8)的人工气候培养箱中进行。二点委夜蛾成虫用10%的蜂蜜水饲喂;幼虫饲养参照一般夜蛾科饲养方法(王伟等，2011)，具体如下:用平底玻璃管饲养幼虫，将初孵幼虫用毛笔挑入加有棉铃虫人工饲料的平底管内，每管6 头，棉塞塞紧管口，幼虫长到3 龄后，转移到装有棉铃虫人工饲料的平底玻璃管中，每管1 头，饲养直至化蛹。

1.2 研究方法

1.2.1 不同昆虫病原线虫种类对二点委夜蛾致病力的测定

选取二点委夜蛾5 龄幼虫为测试对象，测定6种侵染期昆虫病原线虫的侵染力。参照Malan(2011)等的方法，具体步骤如下:24 孔板中垫两层湿润的滤纸，每孔加入50μL 的1000 IJs/mL 线虫悬浮液和1 头二点委夜蛾5 龄幼虫。每处理重复3 次，每个重复20 头供试昆虫，并以不含线虫的灭菌水作为对照，将各处理放入温度为(25±1)℃，相对湿度为80%左右条件下的培养箱中。每隔24 h 检查并记录1 次二点委夜蛾幼虫死亡情况，直至120 h。

1.2.2 二点委夜蛾不同发育阶段对昆虫病原线虫的敏感性测定

以1.2.1 试验部分筛选出的昆虫病原线虫品系为研究对象，分别以二点委夜蛾低龄幼虫(3龄)、末龄幼虫(5 龄)、预蛹期幼虫、蛹为测试对象，测试不同发育阶段的二点委夜蛾对H.bacteriophora HB8 线虫的敏感性，测试方法同1.2.1。每隔24 h 检查并记录1 次二点委夜蛾死亡情况，直至120 h。

1.2.3 不同线虫剂量对二点委夜蛾致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，以二点委夜蛾5 龄幼虫为试虫，将筛选出的线虫品系分别以与二点委夜蛾5龄幼虫数量比为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1的浓度，测定不同线虫剂量对线虫致病力的影响，生测方法同1.2.1，120 h 检查并记录二点委夜蛾幼虫死亡情况。

1.2.4 不同温度条件对线虫致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，以二点委夜蛾5 龄幼虫为试虫，设计5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共7个不同温度条件，测定不同温度条件对线虫致病力的影响，生测方法同1.2.1，放置于湿度为80%的恒温箱内，120 h 检查并记录二点委夜蛾幼虫死亡情况。

1.2.5 不同土壤湿度对线虫致病力的影响

以1.2.1 试验部分筛选出的高致病力昆虫病原线虫品系为研究对象，二点委夜蛾5 龄幼虫为供试昆虫，试验设计0.5%、1%、2%、5%、10%和15%共6个不同含水量的细砂土。具体步骤如下:在直径11 cm×高7 cm 的塑料盒中放入5 cm的一定湿度的消毒细砂土，然后将10 头二点委夜蛾5 龄幼虫放入塑料盒中，并在其上部放入足够人工饲料。每处理各6 盒，然后每盒滴入500μL的1 000 IJs/mL 线虫悬浮液，置于(25±1)℃的恒温箱中，同时设不加线虫500μL 灭菌水作对照。120 h 检查并记录二点委夜蛾幼虫死亡情况。

1.3 数据分析

所有数据采用Excel 进行统计处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同昆虫病原线虫种类对二点委夜蛾致病力的

由表1 可以看出，不同昆虫病原线虫种类对二点委夜蛾5 龄幼虫的致死率差异显著，其中所选择的异小杆属线虫要比斯氏属的线虫致病力高;并且，同一属的线虫之间不同线虫品系对二点委夜蛾5 龄幼虫的致死力也存在较大差异。综合来看，从所选择的6种线虫品系中H.bacteriophora HB8 品系对二点委夜蛾5 龄幼虫致死率最高，处理120 h 后试虫校正死亡率为93.33%，对其有较强的控制作用，可以作为首选的线虫品系应用于该种害虫的生物防治工作中。

表1 6种昆虫病原线虫对二点委夜蛾幼虫的致病力Table 1 Pathogenicity of six EPN species against A.lepigone larvae

2.2 二点委夜蛾不同发育阶段对H.bacteriophora HB8 的敏感性测定

二点委夜蛾不同发育阶段对H.bacteriophora HB8 线虫的敏感性差异显著。由表2 可以看出二点委夜蛾对H.bacteriophora HB8 线虫最敏感时期为5 龄幼虫，其次为3 龄幼虫，经H.bacteriophora HB8 线虫处理后120 h 的死亡率分别达到91.67%和78.18%。二点委夜蛾结茧的预蛹期和蛹期对H.bacteriophora HB8 线虫均不敏感，120 h 的死亡率分别为20%和15%。

表2 不同虫态的二点委夜蛾对H.bacteriophora HB8 线虫的敏感性Table 2 Sensitivity of A.lepigone at different developmental stages to H.bacteriophora HB8

2.3 不同线虫剂量对二点委夜蛾致病力的影响

将筛选出的H.bacteriophora HB8 线虫品系分别以与二点委夜蛾5 龄幼虫数量比为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1 的浓度进行处理，测定不同线虫剂量对线虫致病力的影响。从图1 可以看出在测试剂量范围内，二点委夜蛾5 龄幼虫的死亡率随线虫剂量的增加而上升。其中，当线虫与寄主数量比为50∶1时，其致死率达到91.52%。毒力回归方程为 y=4.7427+0.9348x(R2=0.6253)。

图1 不同剂量H.bacteriophora HB8 对二点委夜蛾致病力的影响Fig.1 Pathogenicity of different dosages H.bacteriophora HB8 against A.lepigone

2.4 不同温度条件对线虫致病力的影响

在不同温度条件下H.bacteriophora HB8 品系线虫对二点委夜蛾5 龄幼虫的致病力有显著差异(图2)。在10℃～30℃范围内，随着温度的升高线虫致病力不断增强，当温度为25℃和30℃时，致病力达到最高值，处理120 h 后试虫的死亡率分别达到91.52%和90%，显著高于其它温度处理。当温度为5℃时和35℃，线虫处理120 h 后试虫的死亡率均为0，说明在此温度下线虫失去了致病力。通过测定可以得出，H.bacteriophora HB8 品系线虫对二点委夜蛾5 龄幼虫适宜的侵染温度为25℃～30℃。

图2 温度对H.bacteriophora HB8 线虫致病力的影响Fig.2 Pathogenicity of H.bacteriophora HB8 at different temperature

2.5 不同土壤湿度对线虫致病力的影响

在温度为(25±1)℃的恒温培养箱内测定了不同土壤湿度条下H.bacteriophora HB8 线虫对二点委夜蛾5 龄幼虫致病力的影响，结果见图3。由图可以看出，在0.5%～15%湿度范围内，该线虫对二点委夜蛾5 龄幼虫的致死率随着湿度的增加而递增，在15%的土壤湿度时，其致死率达到最大值76.27%。

图3 不同土壤湿度下对线虫致病力的影响Fig.3 Pathogenicity of H.bacteriophora HB8 at different soil moisture

3 结论与讨论

在供试的6种线虫中，H.bacteriophora HB8 线虫品系对二点委夜蛾幼虫的致死率最高，进一步测定H.bacteriophora HB8 对不同虫态的二点委夜蛾的侵染力，发现该线虫仅对二点委夜蛾幼虫，特别是对5 龄幼虫有较高的侵染力，而对结茧的预蛹和蛹则很低。Gaugler and Kaya(1990)的研究认为昆虫病原线虫对寄主昆虫幼虫的高侵染力有可能是由于幼虫时期昆虫的自然孔口比较多，对线虫的侵染比较敏感。

土壤中昆虫病原线虫的基数对于有效控制害虫的为害至关重要(刘树森等，2010)。H.bacteriophora HB8 品系不同剂量对二点委夜蛾末龄幼虫的致病力测定结果表明，在相同侵染时间内，线虫对寄主昆虫的致病力基本上是随线虫浓度的增高而增高，在所设5个剂量中，在线虫剂量与寄主昆虫比例为50∶1时的致病力最高。

温度和湿度影响昆虫病原线虫的存活、生长发育、迁移活动、对寄主的侵染能力等(刘树森等，2010)。本试验测试结果是H.bacteriophora HB8 品系侵染二点委夜蛾末龄幼虫适宜温度在20℃～30℃，以30℃和25℃的致病力较高，此试验结果与刘树森(2010)等的研究结果相一致:异小杆线虫沧州品系侵染暗黑鳃金龟幼虫以30℃和25℃的致病力较高。本研究结果还证实当温度为5℃和35℃时该线虫已经丧失了侵染能力，这也与前人Bakonyi and Nagy(2000)、杨平和李素春(1988)的研究结果基本一致:5℃～10℃时线虫基本上不活动，10℃以下线虫不感染寄主;25℃时移动最活跃，25℃～30℃时是较理想的施用温度范围;35℃时线虫丧失致病能力，线虫甚至很快死亡。湿度也是影响线虫防效的重要因子之一(余向阳等，2003)。土壤中含有一定水分，便于在土壤间隙形成水膜，有助于昆虫病原线虫在土壤中移动;土壤湿度还有可能影响线虫的存活率(刘树森等，2010)，在湿度过低的情况下，线虫体内水分蒸发加快，线虫的存活率明显降低(余向阳等，2003)。本试验结果显示随着湿度的增加，H.bacteriophora HB8 线虫侵染活性呈上升趋势。孙瑞红(2004)等在针对H.indica LN2 线虫对韭菜迟眼蕈蚊幼虫侵染力的研究中也证实温度和土壤含水量显著影响线虫的致病力。

目前，利用昆虫病原线虫防治二点委夜蛾的研究在国内还未见报道。本研究筛选出线虫对二点委夜蛾致病力较高的线虫品系—H.bacteriophora HB8，并且明确了该线虫侵染的最佳条件为25℃～30℃温度、15%土壤湿度，二点委夜蛾幼虫特别是5 龄幼虫对H.bacteriophora HB8 线虫最敏感。以上结果仅仅初步证实H.bacteriophora HB8 对二点委夜蛾的防治有潜在的应用价值，但是还需要通过田间试验对H.bacteriophora HB8 防治二点委夜蛾的田间效果进一步评价。

References)

Bakonyi G，Nagy P，2000.Temperature and moisture in duced changes in the structure of the nematode fauna of a semiarid grassland Patters and Mechanisms.Global Change Biology，6(6):697-699.

Gaugler R，Kaya HK，1990.Entomopathogenic Nematodes in Biological Control.CRC Press，Boca.Raton，Florida，139-150.

Hazir S，Kaya HK，Stock SP，Keskin N，2003.Entomopathogenic nematodes(Steinernematidae and Heterohabditidae)for biological control of soil pests.Turkish Journal of Biology，27(4):181-202.

Herbert EE，Goodrich-Blair H，2007.Friend and foe:the two faces of Xenorhabdus nematophila.Nature Reviews Microbiology，5:634-646.

Jiang JY，Li XQ，Xu YH，Li ZH，Zhang ZY，Xu H，2008.Preliminary studies on Athetis(Proxenus)lepigone.Plant Protection，34(3):123-126.［姜京宇，李秀芹，许佑辉，李智慧，张志英，许昊，2008.二点委夜蛾研究初报.植物保护，34(3):123-126］

Jiang XF，Luo LZ，Jiang YY，Zhang YJ，Zhang L，Wang ZY，2011.Damage characteristics and outbreak causes of Athetis lepigone in China.Plant Protection，37(6):130-133.［江幸福，罗礼智，姜玉英，张跃进，张蕾，王振营，2011.二点委夜蛾发生为害特点及暴发原因初探.植物保护，37(6):130-133］

Liu SS，Li KB，Liu CQ，Wang QL，Yin J，Cao YZ，2010.Virulence of Heterorhabditis bacteriophorastrain Cangzhou to larvae of Holotrichia parallela.Plant Protection，36(5):96-100.［刘树森，李克斌，刘春琴，王庆雷，尹姣，曹雅忠，2010.嗜菌异小杆线虫沧州品系对暗黑鳃金龟幼虫的致病力.植物保护，36(5):96-100］

Malan AP，Konetae R，Moore SD，2011.Isolation and identification of entomopathogenic nematodes from citrus orchards in South Africa and their biocontrol potential against false codling moth.Journal of Invertebrate Pathology，108(2):115-25.

Sun RH，Li AH，Han RC，Cao L，Liu XL，2004.Factors affecting the control of odoriphaga with Entomopathogenic nematode Heterorhabditis indica LN2，Natural Enemies of Insects，2(4):150-154.［孙瑞红，李爱华，韩日畴，曹莉，刘秀玲，2004.昆虫病原线虫Heterorhabditis indica LN2 品系防治韭菜迟眼蕈蚊的响因素研究.昆虫天敌，2(4):150-154］

Wang W，Li XH，Zhou C，Mu W，2011.Effect of early rice harvesting and late rice transplanting on population dynamics of brown planthopper，Nilaparvata lugens(Stal)in South China double-cropping rice region.Journal of Environmental Entomology，108(2):115-25.［王伟，李秀环，周超，慕卫，2011.甜菜夜蛾人工饲养技术化.环境昆虫学报，33(1):95-98］

Wang ZY，Shi J，Dong JG，2012.Reason Analysis on Proxenus lepigone outbreak of summer corn region in the Yellow River，Huai and Hai Rivers Plain and the countermeasures suggested.Journal of Maize Sciences，20(1):132-134.［王振营，石洁，董金皋，2012.2011年黄淮海夏玉米区二点委夜蛾暴发危害的原因与防治对策.玉米科学，20(1):132-134］

Yang P，Li SC，1988.Influence of temperature on development and infectivity of Steinernema feltiae.Entomological Knowledge，25(5):300-302.［杨平，李素春，1988.温度对昆虫病原线虫发育和感染力的影响.昆虫知识，25(5):300-302］

Yu XY，Wang DL，Liu JN，Xie P，Lu ZH，Liu XJ，2003.Infectivity of Steinernema carpocapsae Ohio to some insect pests and influence of temperature and humidity under laboratory condition.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，19(1):13-17.［余向阳，王冬兰，刘济宁，解平，卢子华，刘贤进，2003.昆虫病原线虫的室内感染活性及其所受温湿度的影响.江苏农业学报，19(1):13-17］