血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞一氧化氮适度刺激作用的研究

林 凡刘林梅练祝明刘如玉吴世代

（1福建中医药大学中西医结合学院，福州，350122；2福建中医药大学药学院，福州，350122）

血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞一氧化氮适度刺激作用的研究

林 凡1刘林梅2练祝明2刘如玉1吴世代1

（1福建中医药大学中西医结合学院，福州，350122；2福建中医药大学药学院，福州，350122）

目的：探讨血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞一氧化氮（Nitric oxide，NO）产生的影响。方法：以人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell-12，HUVEC-12）为材料，采用不同血府逐瘀汤含药血清浓度和干预时间处理HUVEC-12，检测细胞培养上清液中NO浓度的变化。结果：与空白对照组对比，血府逐瘀汤可在一定干预时间段，适度诱导HUVEC-12胞外NO的产生（P＜0.05）。结论：血府逐瘀汤可能通过适度刺激人内皮细胞NO产生，发挥促进血管新生作用，又避免增生过度的不良反应。

血府逐瘀汤；人内皮细胞；一氧化氮；适度刺激

血府逐瘀汤出自清代名医王清任的《医林改错》，由桃红四物汤合四逆散而成。因瘀阻于胸，妨碍肝之疏泄，疏畅肝气有利于祛瘀，故配四逆散。方中牛膝能祛瘀血、通经脉，并有引瘀血下行的作用；桔梗与枳壳相配，一升一降，行气宽胸，有使气行血畅之功。在中医药现代临床上，该方常用于缺血性心脑血管疾病的治疗，如心绞痛、冠心病等［1］。近年来，血府逐瘀汤对血管新生的促进作用成为该方应用研究的一个新热点［2-5］。NO是一个重要的血管新生调控分子，有报道表明血府逐瘀汤可影响内皮细胞NO的产生［6］。但血府逐瘀汤对人内皮细胞产生NO的影响是短效行为还是长期效应，这尚无明确研究。本研究旨在探讨血府逐瘀汤影响人内皮细胞产生NO的模式，为该药物在血管新生方面的研究提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物 血府逐瘀汤中各药量分别为：当归9 g、生地黄9 g、桃仁12 g、红花9 g、枳壳6 g、赤芍6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g、牛膝9 g。以上药材购于福建省中医药大学国医堂。该方水煎两次，煎液过滤，混合后浓缩至含生药量1.3 g／m L，4℃保存备用。

1.1.2 含药血清制备 根据文献［7］制备，主要步骤如下：SD大鼠，6周龄，体重（200±20）g，SPF级，雌雄各半，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。适应性喂养3d后，随机分为对照组和药物组（血府逐瘀汤组）。药物组按13 g／kg（相当于10倍的人临床用量）剂量灌胃，对照组采用等量生理盐水，每天2次，连续灌胃7 d。末次灌胃2 h后，采血并分离血清，灭活补体并过滤除菌后，-70℃保存备用。

1.1.3 试剂及设备 胰蛋白酶（Trypsin）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）和DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；一氮化氮检测试剂盒（S0021）购自碧云天生物技术研究所；其余试剂均为国产分析纯；IX70倒置相差显微镜及数码摄像装置为OLYMPUS公司产品，二氧化碳培养箱产于Heraeus公司，ELX800全自动酶标仪为BioTek公司产品，细胞培养瓶、培养板购于Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HUVEC-12的培养 HUVEC-12细胞株由本实验室保存，培养。采用DMEM高糖培养液（含10%FBS），置于5%CO2、37℃培养箱中培养。

1.2.2 细胞分泌NO浓度的检测 将对数生长期的HUVEC-12以2×105个／m L的密度接种于细胞培养6孔板。同步化处理后，随机分组，分别用含有不同浓度的含药血清或空白对照血清干预。到达干预培养时间时，收集各组培养上清液，按照试剂盒说明书所述方法进行测定。

1.3 统计分析 利用SPSS 11.5软件对实验中所得数据作Duncan（Duncan’smultiple range test）多重检验。

2 实验结果

2.1 血府逐瘀汤含药血清对HUVEC-12产生NO的刺激作用 与相应浓度的空白对照组相比较，不同浓度（1.25%，2.5%和5%）含药血清干预24 h均刺激内皮细胞NO的分泌（P＜0.01）。其中，2.5%含药血清干预效果最为明显，见表1。这一结果提示，血府逐瘀汤含药血清对内皮细胞NO的产生具有刺激作用，这种刺激作用存在最适药物作用浓度。

表1 不同浓度（%）血府逐瘀汤含药血清对HUVEC-12分泌NO的刺激作用（）

表1 不同浓度（%）血府逐瘀汤含药血清对HUVEC-12分泌NO的刺激作用（）

注：与空白对照组相同血清浓度比较，**P＜0.01。

组别例数血清浓度／%胞外NO浓度／（μmol／L）血府逐瘀汤4 1.25 16.52±2.35**含药血清组4 2.5 22.64±6.31**4 5 14.17±2.01**空白对照组4 1.25 5.34±0.07 4 2.5 5.31±0.83 4 5 5.64±0.51

图1 2.5%血府逐瘀汤含药血清干预时间对HUVEC-12产生NO的影响

2.2 血府逐瘀汤含药血清干预时间对HUVEC-12产生NO的影响 2.5%的空白对照血清干预48 h内，细胞分泌的NO含量无显著变化。而2.5%含药血清处理能引起内皮细胞胞外NO浓度的显著上升，此刺激作用是一个温和、短期效应。具体而言，2.5%含药血清可诱导细胞NO产生，在干预6 h后，细胞培养上清液中的可检测NO浓度有显著上升（P＜0.05），24 h时达到高峰，随即开始下降，48 h时药物诱导效应消失，如图1所示。

3 讨论

NO主要是由细胞内一氮化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）催化底物L-精氨酸形成的一种气体信号分子。在血管内皮细胞中，内皮型一氮化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）被证明参与调节内皮细胞迁移与血管生成［8］。本研究表明，含药血清（1.25%，2.5%和5%）处理人脐静脉内皮细胞（24 h），能显著制激NO的产生。这同其他研究者的报道相吻合［6］。这一结果表明，血府逐瘀汤促血管新生的效果可能与激活内皮细胞eNOS产生NO有关。一系列研究表明，NO调节血管新生的作用与血管内皮生长因子（Vascular Endothelial growth Factor，VEGF）信号途径密切相关。VEGF作用于其受体VEGFR-2后，通过PI3K／Akt-PKB［9］或PKA途径［10-11］，改变eNOS磷酸化水平［12］，调节eNOS活性，刺激内皮细胞NO的产生。另一方面，内皮调节型一氮化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）也可受缺氧等条件诱导，参与VEGF的表达调控［13］。NO还可通过诱导内皮细胞表面的血管舒张来调节血管生成因子的作用，使内皮细胞层在血管生成因子或促细胞迁移因子的作用下呈现出正常的响应，调节血管生成［14］。有报道证实VEGF持续的促血管新生作用会加快动脉粥样硬化［15-17］，增加肿瘤形成和转移的风险，提高其他血管生成源性疾病的机率［18-19］。而血府逐瘀汤在临床实践中则未有相关不良反应的报道。这提示血府逐瘀汤在诱导血管新生的过程中，不是单纯、持续式刺激NO产生，可能存在较为复杂的模式，具体行为必需描述明确。

本研究结果表明，血府逐瘀汤对血管内皮细胞NO产生的诱导作用是一种温和、短期的模式。具体而言，在含药血清干预一段时间后促进内皮细胞NO的产生，刺激效应在24 h后开始下降，48 h时回复至空白对照组水平。血府逐瘀汤对内皮细胞NO产生的适度刺激效应，可能使其在促进血管新生的同时，避免了血管过度增生。这可能是其没有西药治疗所产生的不良反应的因素之一。

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（2013-03-12收稿）

Study on M oderate Stimulation Function of Xuefu Zhuyu Decoction on Levels of Nitric Oxide Released from Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Lin Fan1，Liu Linmei2，Lian Zhuming2，Liu Ruyu1，Wu Shidai1
（1 College of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China；2 College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

Objective：To investigate effects of Xuefu Zhuyu Decoction（XFZYD）on levels of Nitric oxide（NO）released from Human Umbilical Vein Endothelial cells.Methods：Endothelial cells HUVEC-12 were incubated with blank serum or XFZYD containing serum（XFZYD-CS）at different concentrations and different times.Thereafter，the NO concentrations in the culture supernatant liquid were determined.Resu lts：Compared with the control group，XFZYD-CShas amoderate stimulatory effecton NO production of thisendothelial cell line in a period of time.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoctionmoderately increases the endothelial NO concentration to promote angiogenesis without causing overgrown blood vessels.

Xuefu Zhuyu Decoction；Endothelial cell；Nitric oxide；Moderate stimulation

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.023

国家自然科学基金项目（编号：81102844）；福建省自然科学基金项目（编号：2010J05070）；福建省教育厅资助项目（编号：JA11134）；福建中医药大学校管项目（编号：X2009064）