苍鹭致病性沙门菌的分离鉴定及药敏试验

冷 闯，邓舜洲，张文波，蒋新华

（江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌330045）

沙门菌病（Salmonellosis）是由沙门菌属中的一种和几种致病沙门菌（Salmonella）引起的人和多种动物感染的急性和慢性疾病的总称，是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一［1］。美国总统奥巴马支持了欧洲食品安全局的观点，认为沙门菌是引起人类食源性传染病的重要原因，而农场饲养的动物和动物源性食品是人类沙门菌病的重要传染源［2］。苍鹭（Ardea cinerea）属鹳形目，鹭科、鹭属，是一种中型涉禽，在辽宁为夏候鸟［3］。养殖户由于缺乏珍禽养殖技术造成重大经济损失。2001年4月江西省九江市鄱阳湖地区某规模在1 500只左右的苍鹭养殖场，每天死亡苍鹭30只左右，日龄在15日龄到20日龄，并且死亡数量呈递增趋势，本实验室对送检的10只患病苍鹭进行系统诊断，确定为沙门菌所致。

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 高压灭菌器、恒温培养箱、显微镜、摇床、冰箱。

1.1.2 培养基 普通肉汤液体培养基，S.S.琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，8%兔鲜血脱纤维琼脂培养基。培养基均为江西农业大学动物科技学院预防兽医实验室自配，并检验合格。

1.1.3 药敏纸片 环丙沙星、左氧氟沙星、青霉素G、四环素、红霉素、甲氧苄啶、头孢曲松、林可霉素、阿米卡星头孢唑林、氧氟沙星、利福平、哌拉西林、多黏菌素B、壮观霉素、头孢拉定、卡那霉素、呋喃唑酮、氨苄青霉素、强力霉素、庆大霉素。药敏纸片直接均为6mm左右，以上药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 微量生化管 硫化氢、肌醇、水杨苷、枸橼酸、葡萄糖、甘露醇、侧金花、硝酸盐、蔗糖、精氨酸、V－P、七叶苷、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、鸟氨酸。以上微量生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.5 试验动物 6周龄雌性昆明系小鼠5只，购自南昌大学实验动物部。

1.2 试验方法与步骤

1.2.1 病料采集 送检的病苍鹭进行查看，观察到苍鹭肛门下方羽毛都被白色粪便糊住，拉稀很严重，剖检后仔细查看病理变化，发现所有剖检的病例都存在肝脏肿大，出血严重，脾脏肿大，肠道浆膜出血，肌胃与腺胃交界处片状出血非常严重。挑取病变最典型的肝脏进行细菌分离。并且做好记录，拍照留底。

1.2.2 细菌分离及纯化 剖检后采取肝脏用划线接种法接种于8%兔鲜血脱纤维琼脂培养基上，置于37℃恒温培养箱中，培养12～24h，进行革兰染色、镜检，观察细菌形态。根据菌落形态及显微镜观察结果，再挑取单个典型菌落划线接种于8%兔鲜血脱纤维琼脂平板37℃进行多次纯化培养。

1.2.3 初步鉴定 通过多次细菌分离纯化后，挑取最典型的菌落进行涂片、革兰染色以及镜检，首先通过肉眼观察培养基上细菌菌落形态、大小、透明度以及借助显微镜观察细菌的特征。

1.2.4 培养特性观察 在纯培养平板上挑取典型菌落用划线接种法分别接种于S.S.琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中，培养12～24h，观察长出细菌的菌落形态以及在各种培养基上的生长情况。

1.2.5 扩大培养 将普通液体肉汤培养液分装于10支高压灭菌的试管中，挑取兔鲜血平板上分离纯化后的单个菌落于液体培养基中，操作时注意无菌条件，接种完后把试管放进摇床中进行扩大培养，条件是37℃，200r／min，培养24h。

1.2.6 试验动物攻毒 用扩大培养的菌液进行小鼠腹腔注射，两只小鼠注射0.5mL，两只小鼠注射0.2mL，1只小鼠注射0.5mL灭菌生理盐水作为对照，攻毒时注意腹腔注射尽量避免把菌液注射到小鼠皮下，影响小鼠发病及死亡时间，做好染色标记。

1.2.7 试验动物剖检及细菌分离 小鼠攻毒之后注意观察其精神状态和死亡情况，待小鼠死亡后，采用常规剖检方法先将小鼠腹腔打开，再打开胸腔，观察各个脏器的病理变化，摘下肝脏以备分离细菌所用，待剖检后，进行细菌分离操作，以上操作都要求无菌。

1.2.8 致病菌的鉴定 从死亡小鼠肝脏分离的细菌进行革兰染色镜检，对比从原始病料中分离的细菌，最终确定是否是主要致病菌。

1.2.9 生化鉴定 通过纯培养的细菌选择典型菌落接种于8%兔鲜血琼脂固体试管斜面培养基上置于37℃恒温培养箱中培养12～24h，用钩菌环挑选典型单个菌落接种于微量生化鉴定管中，接种完后，微量生化管放于灭菌平皿中切忌要保持水平放置，置于37℃恒温培养箱中，培养24～48h，进行观察，记录结果。

1.2.10 药敏试验 采用琼脂纸片扩增法，用高压灭菌后的棉拭子蘸取扩大培养后的菌液均匀涂布于8%兔鲜血琼脂培养基上，为了保证涂布均匀，需要重复涂布3次，待水分干后，贴上药敏纸片，轻轻按压，确保其贴稳，防止掉落和移动，注意用镊子夹取药敏纸片贴于平板上时要确保药敏纸片完全与培养基接触，以免影响药物扩散不均匀。一个平皿贴7片纸片，最中间一块，其余6块均匀分布其周围。贴好药敏纸片后放入37℃恒温箱中培养12～24h，观察测量抑菌圈的大小，抑菌圈≧20mm为极度敏感；15～20mm为高度敏感；14～10mm为中度敏感；10mm以下大于0为低度敏感；等于0为不敏感。药敏试验操作方法按2005年版CLSI／NCCLS M100－S15所述方法进行。

2 试验结果

2.1 病原菌的鉴定 从苍鹭肝脏分离的细菌在8%兔鲜血琼脂培养基上置于37℃恒温箱中培养12～24h，生长菌落形态都为边缘整齐、光滑、湿润、半透明、略隆起的细小圆形菌落，没有出现溶血环；S.S.琼脂培养基上细菌生长良好，长成半透明、圆形、菌落中间有黑点的小菌落；在麦康凯培养基上都长出半透明、光滑小菌落，挑取典型菌落进行革兰染色，结果为革兰阴性菌，形态都为长杆状或短杆状菌落，多数散在。通过细菌形态观察、染色镜检及生化鉴定结果最终得出该细菌为沙门菌。

2.2 试验动物攻毒 将细菌扩大培养物对小鼠进行腹腔注射后，小鼠全部在12h之内死亡，表中死亡时间为2只小鼠平均死亡时间，具体结果见表1。

表1 动物攻毒试验

2.3 试验动物病理剖检及致病菌鉴定 通过对死亡小鼠进行病理剖检均发现小鼠肝脏肿大、坏死，心外膜少量点状出血，肠道黏膜严重出血，肠壁变薄、变黄，臌气。剖检完死亡小鼠取下其肝脏进行细菌分离，置于37℃恒温培养箱中进行培养，挑取单个菌落进行革染色再镜检观察，发现菌落形态大小、色泽都和原分离菌一致，镜检也发现和原分离菌的形态相同，因此得出原分离细菌为该病例主要致病菌。

2.4 生化鉴定结果 见表2。

2.5 药敏试验结果 见表3。

表2 生化鉴定

表3 药敏试验

3 讨论

沙门菌病和大肠杆菌病属于条件致病菌，人和动物的沙门菌病一直是一个世界性问题［4］，沙门菌菌型繁多，分布广泛，是一种重要的人畜共患病的病原体［5］。沙门菌对于我国畜牧业的威胁越来越大，而且没有很好的有效控制办法，长期以来，以治疗、预防疾病和促进畜禽生长为目的，不合理使用抗生素，导致抗生素过度使用或滥用，在抗生素的选择性压力下，沙门菌耐药性不断上升，这已成为严重的公共卫生问题［6］。据相关文献［1］指出，沙门菌耐药的生化反应机制主要有5种：酶对抗菌药物的修饰或破坏；外输泵介导抗菌药物的主动外排；抗菌药物的渗透障碍，导致药物摄取减少；药物作用靶位的改变；建立新代谢途径，沙门菌发生耐药性常常不是一种生化反应机制起作用，而是两个或多个不同的生化反应机制共同作用。从而可以看出，要解决沙门菌的耐药性问题面临非常严峻的挑战。

本试验分离到的沙门菌可能是由于种蛋带毒或者是由于野生放养于沼泽地而感染沙门菌，鉴于这种可能性，必须对种蛋和沼泽地的泥水进行检测，鉴于我国国情，在生产中常用国标法，有条件的单位应用自动酶标检测仪，ELISA，PCR试剂盒检测［7］，做到从源头消灭病原菌，才能更好地控制沙门菌病。苍鹭养殖属于特种经济动物养殖，养殖规模小，养殖户数量少，可以借鉴的经验更是很少，很多经验都是靠养殖户自己摸索，这无疑会走很多弯路，本试验得出的一些数据可能对于苍鹭养殖能起到一个参考作用。

鉴于本试验得出的结论，对该病例的治疗与预防提出以下建议措施：用环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、甲氧苄啶进行交替使用拌料和饮水，使用多维、中草药等增强免疫力的药物进行辅助治疗；尽量减小养殖密度，保持空气流通；对于投喂的鱼粉饲料要进行把关检测，防治霉变及病菌污染。

［1］张凌云，李昆鹏，张林波.沙门菌生化耐药机制的研究进展［J］.吉林农业，2011，3（253）：64.

［2］Roger Mann，Anitox.salmonella control in the spotlight［J］.Pig progress，2010，26（1）：18－20.

［3］袁宏宇，周正，任秀奇，等.苍鹭繁殖生态习性研究［J］.辽宁林业科技，2003，6：10－12.

［4］Kerstein F K，Motarjemi Y，Bettcher.Foodborne disease control：A transnational challenge.Emerging Infectious disease.http：／lwww.cdc.gov／foodsafety／facts.html.

［5］Timoth，Jones，Diane Eigsti Gerber，Perceived Etiology of Foodborne Illness Among Public Health personnel，http：／／www.cdc.gov／ncidod／disease／eid／index.Htm.

［6］王晓泉，焦新安，陈祥，等.江苏部分地区食源性和人源沙门菌的多重耐药性研究［J］.微生物学报，2007，47（2）：221－227.

［7］孙雨，卜仕金，王美君.沙门菌的毒理作用机制及其检测方法的研究进展［J］.口岸卫生控制，2008，14（2）：56－58.