猪苓对LPS诱导的J774细胞IL-6与iNOS表达的影响

胡金萍 江泽波

中药猪苓为一种药用真菌，味甘淡，性平，目前已广泛用于肿瘤治疗的辅助药物[1-2]。对猪苓免疫作用的研究主要集中在其有效成分——猪苓多糖(PPS)上，研究表明，猪苓多糖具有多种药理功效，特别是在提高免疫功能及抗肿瘤方面作用显著[3]。近年来对猪苓的减毒增效机制研究发现[4]，与PPS相比，猪苓复方在提高机体疫功能的同时还能避免PPS直接给药带来的副作用，这可能与猪苓中含有多种有效成分相互拮抗作用相关。本研究以J 774细胞为载体，观察猪苓对J 774 细胞分泌(IL-6)、iNOS的影响，探讨其免疫调节作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 细胞 J 774 细胞株为广东省中医院中心实验室提供。

1.1.2 药物 猪苓颗粒（江阴天江药业，500 mg/袋，相当于饮片10 g，产品批号：1108049）。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM高糖培养基、胎牛血清（Hyclone）；LPS（055：B 5，Sigma）；MTT（Sigma）；TRizol、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（Invitrogen）；氯仿、异丙醇、二甲基亚砜（广州化学试剂厂）；UV-2450 紫外分光光度计（日本岛津）；二氧化碳恒温培养箱（Thermo）；全自动酶标仪（BIORAD）；实时荧光定量基因扩增系统（ABI，7500 型）；超速冷冻离心机（Beckman）；超净工作台（ESCO）。

1.2 方法

1.2.1 J 774 细胞的培养 细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基培养，待融合度达80%时，弃去培养液，胰酶消化传代，按需分入新瓶中，2～3 d换液一次。

1.2.2 猪苓对J 774 细胞活力的影响

1.2.2.1 细胞分组 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，100 μL/孔接种到96 孔培养板中，细胞分为空白对照组和猪苓给药组（终浓度分别为0.05、0.5、5、50、100、250 μg/mL），每组6 个复孔。

1.2.2.2 MTT法检测猪苓对J 774 细胞活力的影响 待细胞贴壁后，吸弃上清，按上述分组给药，每孔终体积为0.2 mL。37℃，5% CO2环境下培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL/孔，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min使结晶物充分溶解，于OD570处测量每孔吸光值。

1.2.3 猪苓对LPS诱导的J 774 细胞IL-6、iNOS mRNA表达的影响

1.2.3.1 细胞分组 取对数生长期细胞，接种至6 孔细胞培养板中，将细胞分为空白对照组，LPS模型组（终浓度10 μg/mL），猪苓给药组（终浓度0.5、5、50 μg/mL）。待细胞贴壁后，先加入LPS作用2 h，后给予各浓度猪苓,继续培养24 h，空白对照组给予相同体积培养基。

1.2.3.2 引物设计 引物由Invitrogen公司合成，GAPDH上游序列5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′，下游序列5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′；IL-6上游序列5′-GTCTTGGCCGAGGACTAAGG-3′，下游序列5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′；iNOS上游序列5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′，下游序列5′- AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′。

1.2.3.3 荧光定量PCR法检测IL-6、iNOS mRNA的表达 药物处理24 h后按照Trizol reagent说明书提取各组细胞总RNA，进行浓度、纯度和完整性检测后，按照逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板扩增IL-6，iNOS的基因编码片段，各组分主要如下：SYBR Green 10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、cDNA模板10 μL、DEPC水12 μL，反应体系为50 μL，扩增条件：50℃2 min，95℃2 min，95℃15 s，60℃34 s，45 个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△CT法计算相对基因表达。

图1 猪苓对J774细胞活力的影响

图2 猪苓对LPS诱导的J 774 细胞 IL-6、iNOS mRNA表达的影响

2 结果

2.1 猪苓对J 774 细胞活力的影响 与空白对照组相比，在0.5～50 μg/mL剂量范围内，细胞存活率与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明在此剂量范围内的猪苓对J 774 细胞无毒性作用，为排除后续实验中猪苓对IL-6 及iNOS的影响与其细胞毒作用相关，故在此无细胞毒剂量范围内选取3 个浓度进行后续实验。见图1。

2.2 猪苓对LPS诱导的J 774 细胞IL-6、iNOS mRNA表达的影响 由数据分析可见，经LPS诱导后，IL-6、iNOS mRNA的表达量显著上升,与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；加入不同浓度猪苓之后，能够显著抑制LPS诱导的IL-6、iNOS mRNA的表达，并且随着猪苓剂量的增大，其抑制作用越强，具有明显的量效关系，各猪苓给药组与LPS模型组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

3 讨论

巨噬细胞是免疫系统中一类特殊的效应细胞，参与机体的各种炎症和免疫应答过程，LPS为机体产生炎症反应的主要诱导因素之一，巨噬细胞经LPS刺激后，可释放多种炎症因子参与炎症反应，当炎症因子过度表达则会触发机体内炎症瀑布反应，可引起全身炎症反应综合征。IL-6 是一类十分重要的前炎症因子，由单核巨噬细胞、T淋巴细胞等多种细胞分泌，具有广泛的生物学效应，可作用于多种靶细胞而参与免疫和炎症过程，应对包括LPS在内的各种炎性刺激及胞外应激信号，是炎性瀑布过程中的关键因子，IL-6 在组织内过度升高可以引起组织的病理损伤，很多研究表明IL-6 聚集度与局部炎性程度正相关。iNOS由炎症因子、LPS等诱导，iNOS表达上调可导致其介导的炎症因子NO浓度升高，高浓度的NO会导致组织损伤，调节NO的生成及iNOS的表达被认为是治疗炎症疾病的重要手段。综上所述，IL-6、iNOS的表达变化对组织内环境影响重大。在本室既往研究中发现，猪苓及猪苓多糖可协同卡介苗调节膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞表面分子的表达并降低腹腔巨噬细胞NO的释放，进而调节膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的功能，降低NO过度释放对机体组织的损伤作用[5]。在本实验中，猪苓呈浓度依赖性抑制LPS诱导的J 774 细胞IL-6、iNOS的表达，推测IL-6 表达的降低可能是通过下调iNOS的表达，从而抑制炎症介子NO的释放，达到抑制炎症因子及炎症反应的作用。猪苓含有多种组成成分，其抗炎功效的具体有效成分，以及其保护作用是否涉及其他的分子作用机制，还有待继续研究。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：222.

[2]肖建辉，梁宗琦，刘爱英.虫草无性型及其相关真菌多糖的研究开发现状[J].药学学报，2002，37（7）：589-592.

[3]刘洪超，杨小龙，王淑英.猪苓药理作用研究进展[J].河南科技大学学报：医学版，2011，29（2）：159-160.

[4]曾星，李彩霞，黄羽，等.猪苓及猪苓多糖对膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬细胞吞噬和表面相关分子表达的影响[J].中国免疫学杂志，2011，27（5）：414-418.

[5]李彩霞，曾星，黄羽，等.猪苓及猪苓多糖协同卡介苗对膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬细胞功能的影响[J].中国免疫学杂志，2011，27（6）：514-517.