肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用

代立娟 王 琳 冯 澜 (佳木斯大学附属第一医院感染科，黑龙江 佳木斯 154003)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起人类呼吸道感染的主要病毒之一，也是引起婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的重要病原体，尤其是早产儿、先天性心脏病患儿、免疫缺陷的婴儿和儿童更容易发生严重RSV感染。迄今为止，在预防上尚未发现有效的疫苗;目前病毒性疾病的治疗至今仍缺乏特异性强的药物〔1，2〕，而且大多数药物存在严重不良反应。肉桂(Cinnamomum cassia Presl)原名菌桂、牡桂，始载于《神农本草经》。肉桂挥发油中的主要化学成分为肉桂醛(cinnamaldehyde又名桂皮醛)，占52.92% ～61.20%。研究表明，肉桂醛具有很强的医学价值，抗菌作用〔3，4〕抗血小板聚集、抗凝血作用〔5〕抗肿瘤〔6〕升高体表温度〔7〕，除臭〔8〕、抗突变作用，对神经系统有肾上腺素样作用〔9〕等。肉桂醛是存在于天然药物肉桂中的一种有效成分，具有广泛的药理作用，活性较强，可用于治疗多种疾病，具有广泛的临床用途和开发前景。本实验拟通过体外实验，研究验证肉桂醛的抗RSV的能力，为临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株和细胞株 HeLa细胞株和RSV病毒株，由佳木斯大学病理生理学教研室保存。主要试剂肉桂醛、噻唑蓝(MTT)购于Sigma;;胎牛血清和RPMI-1640培养液购于Invitrogen;二甲基亚砜(DMSO)购于上海菲达有限公司。

1.2 药物配制 用RPMI-1640培养液将肉桂醛(10 mg/ml)进行倍比稀释。使药物浓度成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256比例，4℃保存备用。

1.3 病毒毒力测定 以50%细胞培养半数感染量(CCID50)表示病毒毒力。将1 ml病毒接种于已生长达到70%的HeLa细胞中，放入37℃、CO2培养箱培养1 h，加入2 ml 2%的培养液，待细胞发生变性反应后采取反复冻融的方法收集病毒液。然后将提纯过滤的病毒培养液进行10倍系列稀释，使病毒液浓度为10-1、10-2、10-3……10-10。每一稀释度设立8个复孔，同时设空白阴性对照，37℃、CO2培养箱培养3～5 d，同时观察记录细胞病变(CPE)。用 Reed-Muench法求出对细胞的CCID50。

1.4 肉桂醛对HeLa细胞毒性测定 将HeLa细胞接种至96孔中培养，待长成单层时，将已稀释成不同浓度的肉桂醛，分别加入96孔板中培养，每个浓度重复8个复孔，同时设立一个正常细胞对照孔，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，连续培养观察3 d，观察HeLa细胞形态学变化，在培养结束前4 h，吸取培养板中液体，并用磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液冲液冲洗3次，在向每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，置于37℃、CO2培养箱中培养4 h，吸去上清后，每孔加200μl DMSO，微量振荡器振荡5 min，酶标读数仪比色(波长490 nm)测吸光度值。并将实验重复3次。

1.5 肉桂醛对RSV的作用研究

1.5.1 对呼吸道合胞病毒的直接灭活作用 将HeLa细胞接种至96孔中培养，在肉桂醛的无毒浓度范围内，将不同浓度的肉桂醛分别与100 CCID50RSV液等量混合，37℃、CO2培养箱作用2 h后，将其接种在96孔细胞培养板中，37℃ CO2培养箱吸附2 h后，弃上清，加入维持液200μl，每一浓度设8个复孔，并且实验同时设细胞对照组、病毒对照组，然后将其置于5%CO2、37℃培养箱中培养。每日观察细胞致变反应。当病毒对照组细胞病变达75%以上，用MTT法检测细胞的存活率。实验重复进行3次。

1.5.2 在病毒复制阶段肉桂醛对呼吸道合胞病毒的作用 将HeLa细胞接种至96孔中培养，在长成单层HeLa细胞的96孔板上，每孔接种20μl的100 CCID50呼吸道合胞病毒病毒液，37℃ CO2培养箱吸附2 h，吸弃病毒液。在药物无毒范围内加入不同浓度的肉桂醛，每孔200μl，每一浓度设8个复孔，实验同时设细胞对照、病毒对照，其余方法同1.5.1。

1.5.3 对RSV吸附的作用 在药物无毒范围内，不同浓度的肉桂醛分别与100 CCID50的RSV液等量混合后，立即加到已长成单层HeLa细胞的96孔细胞培养板中，37℃ CO2培养箱吸附2 h后，弃去96孔板中液体，加维持液200μl，每一浓度设8个复孔，实验同时设细胞对照、病毒对照，其余方法同1.5.1。

1.5.4 对HeLa细胞的保护作用 在药物无毒范围内，每孔细胞预先加入不同浓度的肉桂醛200μl，37℃作用4 h，然后用PBS洗涤三次，每孔再加入100 CCID50呼吸道合胞病毒，吸附2 h，弃病毒上清，加维持液200μl，每一浓度设8个复孔，实验同时设细胞对照、病毒对照，其余方法同1.5.1。

1.6 统计学方法 应用SAS49.13版统计软件进行分析，用Linear-Regression方法计算药物半数中毒浓度 (TC50)、半数有效浓度 (IC50)和对药物剂量与其产生的细胞效应 (细胞存活率、抑制率)进行相关性分析，判断是否存在量效关系。组间比较采用方差分析。HeLa细胞存活率 (%)=药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值 ×100%，抑制率 (%)=100%-存活率。病毒抑制率=(药物处理组吸光度值-病毒对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值-病毒对照组吸光度值)×100%。距离比例=高于50%病变累积阳性百分数-50%/(高于50%累积阳性百分数-低于50%累积阳性百分数)。治疗指数 (TI)=半数毒性浓度 (TC50)/半数抑制浓度(IC50)。

2 结果

2.1 病毒毒力测定 用显微镜观察细胞病变抑制实验(CPE)，与正常细胞相比，RSV感染后的Hela细胞水肿变圆，细胞膜结构破坏，甚至出现融合，细胞彼此相连呈串样改变。当50%细胞出现病变时，视为CPE阳性细胞，对72 h未出现细胞病变的细胞，视为CPE阴性细胞。采用Reed-Muench法计算RSV在Hela细胞中的CCID50为106.65，实验中病毒攻击量为100 CCID50/100 μl为104.65。见图1。

2.2 肉桂醛对HeLa细胞的毒性作用 肉桂醛对HeLa细胞的毒性作用表现为形态改变(由梭形变为圆形)、细胞间质高度水肿，甚至有部分细胞破碎脱落漂浮、细胞增殖缓慢、细胞颗粒增多、折光性增强等。随着药物浓度的降低而毒性降低，细胞活力逐渐增加。肉桂醛的安全范围为0.001 563～0.003 125 g/L。

2.3 肉桂醛的抗RSV作用研究 光镜下观察正常细胞的对照组细胞培养液清亮，细胞呈多边形或梭形、菱形，排列整齐紧密，细胞间隔清晰，可幼稚连接，连接不紧密，胞质清楚;病毒对照组的HeLa细胞在病毒的直接灭活、病毒复制增殖的抑制作用、病毒吸附阶段的HeLa细胞的CPE表现为:细胞膜、核膜和细胞器的结构破坏，线粒体空泡变化，细胞肿胀、变圆、细胞间融合、脱落、细胞呈串状改变，细胞崩解，胞质及其内容物外泄，最后崩解坏死脱落;而在药物作用组(除对细胞保护作用)大部分HeLa细胞的形态基本与正常形态没有太大变化，仅有部分细胞出现改变，细胞核固缩，细胞呈皱缩状，呈大小不等、形态不规则的碎片状。见图2，图3。

图1 不同浓度肉桂醛下的HeLa细胞的存活率

图2 各组HeLa细胞(×200)

MTT实验结果表明，在病毒的直接灭活、病毒复制增殖的抑制作用、病毒吸附阶段(除细胞保护作用下)三种作用方式，肉桂醛在这三种形式中随着药物浓度的增加HeLa细胞的存活率，从而达到抑制RSV的增殖作用。且在有效的无毒范围内的肉桂醛和HeLa细胞存活率之间呈现一定的联系。表现在随着肉桂醛浓度(在无毒范围内)的增加，细胞形态改变、融合坏死脱落等典型CPE特征逐渐减弱，大部分HeLa细胞的形态基本与正常形态没有太大变化，细胞存活率明显升高。见表1，表2。直接灭活、生物合成、吸附作用的 IC50分别为 0.001 2、0.003 5、0.003 0，TI分别为 31.25、10.71、12.50。

表1 不同方式作用下肉桂醛对RSV的细胞致病变效应

图3 肉桂醛的抗RSV作用(×200)

表2 不同方式作用下HeLa细胞的存活率(%)

3 讨论

RSV广泛流行于世界各地，它是引起婴幼儿呼吸道感染的最重要的病原微生物之一，也常引起成人特别是老年人感染，它可以引起不同程度的感染甚至是重症感染，同时也是导致某些免疫抑制人群发病和死亡的重要原因。RSV一般通过空气飞沫和密切接触传播传播，感染途径容易实现。RSV的感染多见于新生儿和6个月以内的婴儿，男多于女。我国北方多见于冬春季，南方则多见于春夏季。RSV是一种单股负链RNA病毒，属副黏液病毒科，外被包膜，能吸附宿主细胞，细胞间黏附分子囊膜表面的跨膜糖蛋白有融合蛋白F、吸附蛋白G和小疏水蛋白SH，它们介导病毒黏附，能使RSV吸附于宿主细胞上，从而导致感染的开始能引起病毒囊膜与宿主细胞膜融合，有利于病毒穿入细胞。因而要求抗病毒药物既能有效地抑制病毒的增殖，而又不损伤宿主细胞。中药同西药相比具有筛选时间短，资源丰富，同时又可以节省人力、物力、财力，而且具有毒性低和副作用小等传统优势。肉桂醛是肉桂油中的主要物质，肉桂醛的许多要用作用已经应用与临床，本实验主要研究肉桂醛抗RSV的作用机制。首先检测肉桂醛的最大无毒浓度和CCID50，然后采用CPE和MTT方法检测做相关分析。结果显示肉桂醛治疗组(病毒的直接灭活作用方式;病毒复制增殖的抑制作用方式;病毒吸附的抑制作用方式)细胞形态正常，仅有少量细胞出现异常的形态及结构改变，说明肉桂醛在病毒的直接灭活作用方式、病毒复制增殖的抑制作用方式、病毒吸附的抑制作用方式下具有抑制RSV的作用。在肉桂醛的无毒范围内，随着肉桂醛药物浓度的增加，细胞存活率明显增加。但是在细胞保护方式作用下，研究证明，肉桂醛组细胞出现的细胞间融合、线粒体空泡，细以及细胞的脱落坏死等CPE病变、细胞存活率以及药物浓度与病毒组都没有明显差别。上述实验结果表明肉桂醛有抑制RSV作用，肉桂醛在三种作用方式下(直接灭活阶段病毒复制阶段和病毒吸附阶段)具有抗RSV作用。肉桂醛具能明显抑制RSV的生物学合成，但是不能保护宿主细胞预防RSV的入侵;对肉桂醛的抗RSV作用的临床作用尚待进一步研究。

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