三七总皂苷对大鼠脊髓半横断损伤后的神经保护作用①

皮斌，孙扬，熊巍，沈田，周志扬

三七总皂苷对大鼠脊髓半横断损伤后的神经保护作用①

皮斌1，孙扬2，熊巍2，沈田2，周志扬2

目的探讨三七总皂苷(PNS)对大鼠脊髓半横断损伤后继发性损害的神经保护作用及相关机制。方法55只成年Sprague-Dawley大鼠随机分成3组：假手术组(n=5)、脊髓损伤组(n=25)和PNS组(n=25)。造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d应用BBB评分标准对大鼠后肢运动功能进行行为学评分，相应时间点取材后对大鼠脊髓组织进行病理形态学观察和免疫组化分析。结果PNS干预后3 d、7 d、14 d和21 d时PNS组大鼠运动功能恢复优于脊髓损伤组(P＜0.05)。7 d、14 d和21 d时PNS组尼氏染色示神经元坏死减少，形态完整，且胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)阳性细胞数减少，神经元形态完整，cPLA2表达增强被抑制。结论PNS可通过抑制cPLA2表达在脊髓损伤中发挥神经保护作用，促进运动功能恢复。

三七总皂苷；脊髓损伤；胞浆型磷脂酶A2；大鼠

[本文著录格式]皮斌，孙扬，熊巍，等.三七总皂苷对大鼠脊髓半横断损伤后的神经保护作用[J].中国康复理论与实践, 2013,19(10):922-926.

脊髓损伤包括原发性损伤与继发性损伤。研究表明，缺血、缺氧、炎症反应、氧化应激、钙超载、兴奋性毒性等多种病理因素介导的损害作用参与继发性脊髓损伤，显著地扩大损伤的范围与程度[1]。目前脊髓损伤的研究热点在于对继发性脊髓损伤的有效干预，促进神经细胞修复与再生。因此，针对继发性损伤有害因素的干预是提高患者生活质量，改善预后的关键。

近期的研究发现，脊髓损伤后胞浆型磷脂酶A2 (cytosolic phospholipase A2,cPLA2)表达与活性普遍升高，通过对花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的酶解作用产生大量脂质产物，促进炎症发生与活性氧生成，从而导致大量神经元与神经胶质细胞坏死、凋亡[2-3]。针对cPLA2的抑制剂均可有效促进脊髓损伤的修复，发挥神经保护作用，说明cPLA2为脊髓损伤病理过程中的重要分子[4]。

三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)主要由人参皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1、R2等40多种皂苷组成，临床常用来治疗心脑血管、中枢神经系统等方面的疾病。现代药理学研究表明，PNS能有效抑制血小板聚集与抗脂质过氧化，改善微循环，扩张痉挛血管，增加血流量，阻断钙离子内流，可能在脊髓损伤中发挥保护作用[6-7]。本研究利用脊髓半横断模型大鼠探讨PNS对脊髓损伤的保护作用，并观察治疗效果，初步探讨其机制。

1材料与方法

1.1实验动物与分组

55只健康成年Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，体重200～250 g，由中南大学实验动物学部提供。随机分为3组：假手术组(n=5)、脊髓损伤组(n=25)和PNS组(n=25)。PNS组在脊髓损伤造模成功后15 min经腹腔给予PNS 20 mg/kg，以后每天给药1次，而假手术组和脊髓损伤组在相同时点经腹腔注射等量0.9% NaCl溶液。

1.2试剂与仪器

小牛血清冻干粉(SIGMA)，TrintonX-100(SIGMA)，兔抗鼠cPLA2(Santa Cruz)，生物素化羊抗兔IgG(Vector)，ABC试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，PNS(广西梧州制药)，双人双目手术显微镜(GX.SS.2223，上海)，显微镜(Olympus, Japan)，冰冻切片机(ShanDon,England)，图像分析系统(Motic ImagesAdvanced 3.2)。

1.3动物模型制作

脊髓损伤组和PNS组大鼠称重，10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，俯卧位固定，手术区剪毛，络合碘消毒，以T10棘突为中心做背部正中切口，长3～4 cm，显露T9～T11棘突及椎板，咬除T9椎板直至显露脊髓后动脉。以脊髓后动脉为中点，扎银针定位，刀片沿银针往下插入，直至触及骨质，然后向外侧横断该侧脊髓。术后在切口处用0.9%NaCl溶液冲洗，并加入少量青霉素钠粉末防止感染，逐层缝合肌肉、筋膜及皮肤后单笼饲养，定时喂食，给水，保持垫料干燥。

造模成功标志：动物麻醉苏醒后，损伤侧后肢自主运动消失，但有感觉，对侧丧失感觉但活动自如。

假手术组大鼠单纯切除椎板，不横断脊髓。

造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d处死大鼠进行取材。4%多聚甲醛溶液经主动脉插管灌注固定后取距损伤区0.5 cm上下两段脊髓组织。标本经多聚甲醛固定4 h后经梯度蔗糖溶液脱水，标本放入-70℃冰箱保存。

1.4行为学观察及评分

评定者不参与动物模型制作，对所观察动物接受的处理不知情。参照改良BBB后肢运动功能评分表[8]，评分时将动物置于平坦开阔处观察后肢关节活动度和范围、运动协调程度、承重情况等，观察时间约为5 min。运动功能共分为22个等级，0分为全瘫，21分为完全能自如运动。假手术组每个时间点评定同一只大鼠。

1.5病理形态学检查

标本取出后经PBS缓冲液包埋，在恒冷切片内行连续切片，片厚15 μm，尼氏染液染色，光镜下观察前角运动神经元及其周围神经组织形态学变化。

1.6 cPLA2免疫组织化学检测

切片脱蜡水化后，用3%H2O2室温孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清室温封闭20 min后加入1∶100稀释兔抗大鼠cPLA2抗体，4℃过夜。PBS冲洗后滴加生物素化羊抗兔IgG，室温下20 min。0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次3 min。DAB溶液室温下显色5 min，PBS冲洗终止显色。最后用苏木素复染，二甲苯透明后中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，排除二抗的非特异性染色。阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。

1.7图像处理

利用Image J软件对免疫组化切片图像进行分析。每组取3张切片，导入图像系统后每切片随机选择5个不重叠的高倍镜视野，测定免疫组化阳性染色面积。

1.8统计学分析

各组实验数据以(±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析，与对照组比较应用成组t检验，各组间比较应用方差分析。

2结果

2.1行为学观察及评分

术前所有动物BBB评分均为21分。造模成功后当天，脊髓损伤组动物均出现左后肢全瘫，术后前3 d BBB评分较低，与脊髓休克期一致。损伤后7 d起，脊髓损伤组与PNS组运动功能逐渐恢复。3 d、7 d、14 d和21 d时PNS组BBB评分高于脊髓损伤组(P＜0.05)。见表1。

表1 脊髓损伤后不同时间点各组大鼠运动功能BBB评分

2.2病理形态学检查

7 d、14 d和21 d的病理切片光镜下显示：①假手术组，大鼠脊髓组织神经元形态完整，胞浆内尼氏小体清晰可见。②脊髓损伤组，脊髓组织正常结构丧失，灰质形成较大空腔，少见完整的细胞结构，可见明显神经胶质细胞增生反应。多数神经元胞核溶解，胞浆混浊，见不到尼氏小体。白质区出现数量不等的微囊。③PNS组：脊髓组织结构比较清晰，损伤侧的灰质内偶见小空腔，有较多的正常神经元，仅有轻度的神经胶质细胞增生反应。神经元细胞核稍浓聚，核膜完整，胞浆内尼氏小体清晰可见，轴突清晰完整，白质区微囊变较脊髓损伤组明显减少。见图1。

图1 不同时间点各组大鼠前角运动神经元形态改变(尼氏染色，400×)

2.3 PNS干预后cPLA2表达变化

cPLA2免疫组化显示，脊髓损伤后3 d起脊髓损伤组cPLA2表达增加，免疫阳性细胞数增多，神经元胞体肿胀。而PNS组cPLA2阳性细胞数较少，且cPLA2免疫阳性面积较少，神经元形态更为完整，周围神经组织破坏程度较轻。在7 d、14 d和21 d时脊髓损伤组cPLA2表达均强于PNS组。见表2和图2。

表2 脊髓损伤后各组不同时间点cPLA2免疫阳性面积值

注：PNS组与假手术组比较，a:t=2.10,P=0.03;b:t=4.51,P=0.001;c:t=6.25,P=0.001;d:t=7.14,P=0.001;e:t=6.45,P=0.001。PNS组与脊髓损伤组比较，f:t=1.31,P=0.23;g:t=1.68,P=0.13;h:t=3.07,P=0.015;j:t=2.45,P=0.04;k:t=2.48,P=0.04

图2 PNS组与脊髓损伤组脊髓损伤节段cPLA2表达(免疫组化，400×)

3讨论

近年来，国内外学者发现，在原发损伤基础上发展起来的一系列病理改变是导致脊髓组织发生不可逆的进行性变性、坏死的主要原因，而这种继发性损伤是神经元丢失的主要环节[9-10]。目前认为，多种因素参与脊髓损伤继发性损害，如炎症反应、自由基、兴奋性毒性、Ca2+超载等。因此，在损伤急性期如何减轻或消除继发性病理反应，保护残存的轴突和神经元不再遭受继发性损伤，是目前脊髓损伤治疗研究的重点和热点。

cPLA2在神经系统退行性疾病及缺血缺氧性疾病中的损伤作用已被广为证实，而cPLA2抑制剂的神经保护作用也在大量文献中报道。近期研究证实，cPLA2广泛参与包括阿尔茨海默病、脊髓损伤、多发性硬化在内的多种神经系统疾病过程，且cPLA2的表达增高均与炎症反应和氧化应激相关[11]。同时，cPLA2敲除大鼠在脑缺血损伤中缺血梗死面积、脑细胞水肿均得到缓解，神经系统评分更为良好，说明cPLA2为参与神经系统损伤的重要分子。

大量实验研究表明，脊髓损伤后cPLA2表达与活性显著增强，分解膜磷脂释放大量AA，产生炎症反应并诱导氧化应激，导致神经损伤[12]。应用免疫荧光双标方法发现，cPLA2主要定位于神经元与少突胶质细胞，损伤轴突及星型胶质细胞也可见cPLA2表达增强。cPLA2是水解膜磷脂的关键酶，可特异性水解神经细胞膜磷脂，释放大量AA，而AA经环氧合酶(cyclooxygenase,COX)、脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX)代谢后产生的脂类炎性介质如血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等广泛参与炎性反应与氧化应激，并可改变局部损伤区血流动力学，进而加重损害，诱导细胞坏死、凋亡。同时在体外实验中发现，cPLA2激活剂蜂毒素干预后能明显促进神经元凋亡、脱髓鞘化与氧化损伤[13]。而上述效应均能被cPLA2抑制剂米帕林逆转，说明cPLA2为参与脊髓继发性损伤的重要分子。

三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的根，主要活性成分是PNS。中医学理论指出，三七具有化瘀止血、活血定痛之效，广泛应用于脑卒中等疾病的治疗。人参皂苷单体Rb1在短暂性脑缺血模型中，可显著减少梗死面积，并减少再灌注后小胶质细胞的活化[14]。实验室前期工作发现，在脑缺血再灌注动物模型中，PNS(25 mg/kg)能有效降低TUNEL阳性细胞数，并能抑制caspase-1与caspase-3的表达，为一种极具潜力的神经保护剂[6]。本研究中，经PNS干预后脊髓损伤大鼠运动功能恢复优于脊髓损伤组，PNS组在3 d、7 d、14 d和21 d评分高于脊髓损伤组，说明PNS有助于大鼠神经功能恢复。选取损伤区脊髓组织行尼氏染色后发现，PNS可保持神经元完整性，神经元坏死和破坏减少，周围神经组织更为完整，说明PNS可在形态学上发挥神经保护作用。

研究表明，PNS可抑制诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶活性与中性粒细胞浸润，调节AA代谢，改变AA家族中对血小板聚集和血管舒缩有作用的前列环素(prostacyclin,PGI2)与血栓素 A2(thromboxane A2, TXA2)之间的相互关系，纠正PGI2-TXA2之间的比例失衡，促进神经修复[15-16]。

那么PNS在脊髓损伤中的神经保护机制是否与AA代谢的关键酶cPLA2相关呢？本实验发现，脊髓损伤后PNS对cPLA2的表达有明显的抑制作用，在7 d、14 d和21 d时PNS组cPLA2免疫阳性面积均低于脊髓损伤组，且经PNS干预的神经元形态完整，肿胀坏死少于脊髓损伤组，提示PNS可通过抑制cPLA2表达在脊髓损伤中发挥神经保护作用。

[1]Ling X,Liu D.Temporal and spatial profiles of cell loss after spinal cord injury:Reduction by a metalloporphyrin[J].Neurosci Res,2007,85(10):2175-2185.

[2]David S,Greenhalgh AD,López-Vales R.Role of phospholipase A2s and lipid mediators in secondary damage after spinal cord injury[J].Cell Tissue Res,2012,349(1):249-267.

[3]López-Vales R,Ghasemlou N,Redensek A,et al.Phospholipase A2 superfamily members play divergent roles after spinal cord injury[J].FASEB J,2011,25(12):4240-4252.

[4]Zhao Z,Liu N,Huang J,et al.Inhibition of cPLA2 activation by Ginkgo biloba extract protects spinal cord neurons from glutamate excitotoxicity and oxidative stress-induced cell death[J].J Neurochem,2011,116(6):1057-1065.

[5]Dacid S,Zarruk JG,Ghasemlou N.Inflammatory pathways in spinal cord injury[J].Int Rev Neurobiol,2012,106:127-152.

[6]Li H,Deng CQ,Chen BY,et al.Total saponins of Panax Notoginseng modulate the expression of caspases and attenuate apoptosis in rats following focal cerebral ischemia-reperfusion[J].J Ethnopharmacology,2009,121(3):412-418.

[7]Gu B,Nakamichi N,Zhang WS,et al.Possible protection by notoginsenoside R1 against glutamate neurotoxicity mediated by N-methyl-D-aspartate receptors composed of an NR1/ NR2B subunit assembly[J].J Neurosci Res,2009,87(9):2145-2156.

[8]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight drop device versus transaction[J].Exp Neurol,1996, 139(2):244-256.

[9]谢少华,杨拯,龚都,等.原花青素对脊髓损伤大鼠运动功能的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(9):831-834.

[10]熊文平,江普查,武栋成,等.神经干细胞与骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复的比较[J].武汉大学学报(医学版), 2013,34(1):50-57.

[11]Shibata N,Kakita A,Takahashi H,et al.Increased expression and activation of cytosolic phospholipase A2 in the spinal cord of patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis[J].Acta Neuropathol,2010,119(3):345-354.

[12]López-Vales R,Ghasemlou N,Redensek A,et al.Phospholipase A2 superfamily members play divergent roles after spinal cord injury[J].FASEB J,2011,25(12):4240-4252.

[13]Liu NK,Zhang YP,Titsworth WL,et al.A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury[J]. Ann Neurol,2006,59(4):606-619.

[14]Zhu J,Jiang Y,Wu L,et al.Suppression of local inflammation contributes to the neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 in rats with cerebral ischemia[J].Neuroscience,2012,27(202): 342-351.

[15]Jin UH,Park SG,Suh SJ,et al.Inhibitory effect of Panax Notoginseng on nitric oxide synthase,cyclo-oxygenase-2 and neutrophil functions[J].Phytother Res,2007,21(2):142-148.

[16]Ma L,Uchida H,Nagai J,et al.Evidence for de novo synthesis of lysophosphatidic acid in the spinal cord through phospholipase A2 and autotaxin in nerve injury-induced neuropathic pain[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,333(2):540-546.

Protective Effect of Panax Notoginseng Saponins in Spinal Cord Hemisection Injured Rats

PI Bin,SUN Yang,XIONG Wei,et al.Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215021,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and cytosolic phospholipase A2(cPLA2)associated mechanism of panax notoginseng saponins(PNS)in spinal cord hemisection injured rats.Methods55 adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:sham group(n=5),spinal cord injury group(n=25)and PNS group(n=25).The rats were evaluated with BBB score,pathology and immunohistochemistry 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d after intervention.ResultsCompared to the spinal cord injury group,motor recovery was significantly better in PNS group 3 d,7 d,14 d and 21 d after intervention(P＜0.05).Nissl staining showed less neuron necrosis and more integrated neural cells in morphology in PNS group 7 d,14 d and 21 d after intervention.Cytosolic phospholipase A2(cPLA2)expression was inhabited,and less number of positive cells were found in PNS group 7 d,14 d and 21 d after intervention.ConclusionPNS can inhibit the expression of cPLA2 after spinal cord injury,which may be one of the mechanisms of its effect on promoting motor recovery.

panax notoginseng saponins;spinal cord injury;cytosolic phospholipaseA2;rats

R651.2

A

1006-9771(2013)10-0922-05

2013-04-09

2013-09-11)

1.苏州大学附属第一医院骨科，江苏苏州市215021；2.中南大学湘雅医学院，湖南长沙市410001。作者简介：皮斌(1985-)，男，汉族，湖南常德市人，博士，医师，主要研究方向：脊柱外科基础及临床。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.10.006