蓝花参内生真菌的初步分离鉴定

江云，王少华,2，王铮敏,2

(1.三明学院资源与化工学院，福建三明365004；2.三明学院应用生物技术研究所，福建三明365004)

蓝花参内生真菌的初步分离鉴定

江云1，王少华1,2，王铮敏1,2

(1.三明学院资源与化工学院，福建三明365004；2.三明学院应用生物技术研究所，福建三明365004)

为探索蓝花参（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）内生真菌的种类，对蓝花参植物的茎、叶进行内生真菌的分离纯化，获得10株内生真菌，表明蓝花参内生真菌的多样性较为丰富；其中产孢特征明显的4株经形态学鉴定分别属于大果粗孢曲霉属(Lilliputia Boud.et Pat.)、链格孢属(Alternaria Nees)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces Linder)和双足囊菌属(Dipodascus Lagerh.)。

蓝花参；内生真菌；分离；多样性

蓝花参（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）是桔梗科蓝花参属植物，别名寒草、金线吊葫芦等，分布于福建各地且民间应用广泛[1-2]。已有的研究表明，蓝花参有抗菌、杀菌、抗炎、抗癌、免疫力抑制等作用，可补虚健脾、化痰止咳、保护乙醇造成的胃粘膜受损等功效[3-4]；全草含植物甾醇、三萜成分、内酯、香豆素、多糖、酚性成分等[5-6]，其化学成分复杂且含量极低、不易提取[7-9]。但对其内生真菌的多样性、内生真菌的发酵及其产物的鉴定、发酵产物中是否含有类似生物活性物质等研究目前尚未见文献报道。本文采用传统形态学鉴定法尝试对蓝花参内生真菌进行初步分离鉴定，以期了解其多样性，为今后寻找利用真菌发酵生产天然药物的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康粗壮的蓝花参全草采自福建省三明市三明学院校园。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA），查氏培养基[10]。

1.3 内生真菌的分离、纯化

根据杨春燕等分离方法[11-13]稍做修改。

用自来水流水冲洗、去除植株污泥后，用20％洗衣粉浸泡10 min；再用自来水流水冲洗30 min后置于干净的纱布上；用吸水纸吸干植物体的表面水分。

（1）样品的表面消毒：取植物的茎和叶分别用无菌水洗净、切割后进行表面消毒，处理方法见表1。

表1 植物样品的表面消毒

（2）内生真菌的分离：将表面消毒后的植物样品用无菌手术剪剪切（茎段去掉两端、再剪切成0.2 cm小段；叶片除去边缘四周，再剪切成0.5 cm×0.5 cm），放置在PDA培养基平皿上，置22℃温箱中培养。培养3～7 d后即可见样品边缘有菌丝长出，挑取菌丝到PDA平板上分离、纯化；纯化后的菌株转到PDA斜面培养基上4℃保存备用。

为检查表面消毒和无菌操作是否彻底，设对照1：未切割两端和任何剪切的消毒茎段；对照2：未做任何剪切的消毒叶片；对照3：在超净台上放置5个敞开盖子的PDA培养基平皿，直到实验完成；对照4：将升汞消毒后的最后一次漂洗无菌水涂布于PDA培养基上。将上述对照同样置22℃温箱中培养。结果均无任何菌丝长出，证明植物组织块表面消毒彻底，无菌操作合格，确保筛选到的菌种为内生真菌。

1.4 内生真菌的鉴定

采用点植培养法[10]，挑取微量菌丝点植在查氏培养基平板的中心位置，然后于28℃温箱培养10 d，记录每天菌落的大小、颜色、表面纹饰、质地、高度、菌落边缘形状等。

内生真菌的形态学鉴定[14-16]：用查氏培养基培养分离纯化过的菌种数日后，挑取菌丝或孢子用溴酚蓝染色制成玻片，在显微镜下观察孢子形态、产孢结构、菌丝颜色及有无横隔等特征。

2 结果

2.1 蓝花参内生真菌的分离

对样品表面长出的菌丝进行分离纯化，结果见表2。

2.2 蓝花参内生真菌的鉴定

对纯化菌株菌丝及分生孢子的形态学特征进行观察，鉴定出4种具有明显的孢子形态的内生真菌分别属于大果粗孢曲霉属（Lilliputia Boud. et Pat.）、链格孢属（Alternaria Nees）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces Linder）和双足囊菌属（Dipodascus Lagerh.），结果见表3和图1～4。

表2 内生真菌的分离结果

表3 内生真菌的鉴定结果

续表3

图1 Lilliputia Boud.et Pat.（LJ1）（×40）

图2 Alternaria Nees（LJ3）（×40）

图3 Schizosaccharomyces Linder（LJ7）（×40）

图4 Dipodasous Lagerh.（LY1）（×40）

3 结论与讨论

本实验采用马铃薯葡萄糖培养基，以75％酒精和0.1％升汞作表面消毒剂，从蓝花参植物分离到10株内生真菌，显示蓝花参内生真菌的多样性较为丰富。对其中产孢子且孢子特征明显的4种进行鉴定、分别为半知菌亚门的4个属：大足粗孢曲霉属(Lilliputia Boud,et,Pat)、链格孢属(Alternaria Nees)、裂殖酵母属(Schinosaccharomyces Linder)、双足囊菌属(Dipodasous Lagerh)。

在纯化的10个菌株中，只对产孢子且孢子特征明显的4种进行鉴定，还有不产孢子或孢子特征不明显的6种还需通过促孢子培养等实验进一步完成，说明用传统形态学鉴定内生真菌存在一定局限。后续研究中可以通过分子生物学手段进行ITS序列的测定，更加快速、准确地了解蓝花参内生真菌的种类。实验植株的选取可能对内生菌株的产生多寡有一定关系。选用健康粗壮的植株能够获取更多的内生菌株，但是否有关联有待进一步研究。

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Separation of the Endophytic Fungus on Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC. of Fujian Sanming

JIANG Yun1,WANG Shao-hua1,2,WANG Zheng-min1,2
(1.School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Institute of Applied Biotechnology,Sanming College,Sanming 365004,China)

10 strains of endophytic funguses were separated from the stems and the leaves of Wahlenbergia marginata (Thunb.)A.DC.in order to explore its species.The results showed that the endophytic funguses of Wahlenbergia marginata own a great variety of diversity,which 4 strains were classified into Lilliputia Boud.et Pat.,Alternaria Nees,Schizosaccharomyces Linder and Dipodascus Lagerh.based on morphological characters.

Wahlenbergia marginata；endophytic fungi；separate,diversity

Q93.331

A

1673-4343（2013）06-0067-04

2013-09-28

福建省教育厅科技项目（JA10264）;三明市科技局科技项目（2009-s-1）;福建省高校服务海西重点项目（HX200801）

江云，男，福建福州人，大学生。通讯作者：王铮敏，女，福建福州人，副教授。研究方向：植物学。