盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒包封率的测定

杨 栋 王 玮 张永玲

1.河南省郑州人民医院，河南郑州 450000；2.河南大学药学院，河南开封 475000

盐酸氟桂利嗪（flunarizine hydrochloride，FNZ）化学名为（E）-1-[双（4-氟苯基）甲基]-4-2（2-丙烯基-3-苯基）-哌嗪二盐酸盐。类别：血管扩张药。性状：本品为白色或类白色结晶或结晶性粉末；无臭；无味。本品是一种钙离子通道阻断剂[1]，能防止因缺血等原因导致的细胞内病理性钙超载而造成的细胞损害，适用于脑动脉硬化、脑血栓形成、高血压所致的脑循环障碍、脑出血、头部外伤及其后遗症。固体脂质纳米粒（SLN）结合了聚合物胶束和水包油性脂质纳米乳的优点[2]，同时避免了这两种的缺点，因此是一种特别具有潜力的药物载体[3]。本实验采用盐酸氟桂利嗪作为包封对象，通过溶剂乳化冷却固化法制备盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒，以达到对脑的靶向作用。对于载药固体脂质纳米粒包封率的测定，涉及到游离药物与固体脂质纳米粒的分离。常见的分离方法主要有透析法﹑离心法和葡聚糖凝胶法等。影响包封率的因素很多，如药物-类脂比﹑类脂的种类﹑药物的性质及制备方法等[4]。所以包封的药物不同，固体脂质纳米粒的种类及所用脂质材料不同，适宜采用的测定方法亦不相同。本次实验旨在采用这三种常见的分离方法进行分离，并从中寻找到对于盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒及其游离药物分离的较好方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

0516-1台式离心机 （上海医疗器械有限公司），CL-3型恒温加热磁力搅拌器 （郑州长城科工贸有限公司），JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机 （宁波新芝科技股份有限公司），S-250D超声波清洗器 （宁波科生仪器厂），P230型高效液相色谱仪（大连依利特公司），EC2000色谱工作站（大连依利特分析仪器有限公司），AT-330柱恒温箱 （天津奥特赛恩斯仪器有限公司），色谱柱：ODS-C18柱（200 mm×4.6 mm，大连依利特分析仪器有限公司），透析袋（北京科百奥生物科技有限公司）。

1.2 试药

盐酸氟桂利嗪 （郑州康瑞制药有限公司，批号：20111002），豆磷脂（上海恒信化学试剂有限公司，批号：20091115），硬脂酸（浙江日用海盐化工厂，批号：20100301），Poloxamer188（南京威尔化工有限公司，批号：20111107），SephadexG-50（北京瑞达恒辉科技发展有限公司，批号：20091017），甲醇（天津市福晨化学试剂厂，色谱纯）。

2 方法与结果

2.1 盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒的制备

采用溶剂乳化冷却固化法制备盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒。将处方量Poloxamer188在（75±3）℃下分散均匀制成水相；在相同温度下将豆磷脂、盐酸氟桂利嗪和硬脂酸分别溶解于无水乙醇和二氯甲烷中，然后将两者混合均匀成有机相；将有机相逐滴加入水相中，此过程中保持水浴温度在（75±3）℃及水相的搅拌速度为1 000 r/min。然后在该温度下将其混合后的溶液浓缩至8 mL，将浓缩液快速加入另一0℃的水相中，然后经超声波细胞粉碎机超声后即制得分散均匀的盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒混悬液[5]。

2.2 色谱条件

色谱柱：ODS-C18（200 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.36 g，加水溶解稀释成1 000 mL，加三乙胺 4 mL，用磷酸调 pH 值至 3.5）（75︰25）[1]；流速：1.0 mL/min；检测波长：253 nm；柱温：30 ℃，进样量：20 μL。

2.3 标准曲线的绘制

分别精密吸取浓度为20 μg/mL的FNZ贮备液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 置 于 10.0 mL 容 量 瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/mL 的系列溶液。 在“2.2”项色谱条件下分别取上述标准系列溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以盐酸氟桂利嗪峰面积（A）对盐酸氟桂利嗪浓度（C）进行线性回归。回归方程为：A=43.565C+0.5811（r=0.9997）。 即盐酸氟桂利嗪在 0.1～5.0 μg/mL 范围内，峰面积（A）与测定浓度（C）呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密量取浓度为20 μg/mL的FNZ贮备液适量，分别用流动相稀释成浓度为1.0、3.0、5.0 μg/mL的溶液，在一天内每隔2小时进样1次，共测定3次，将测得的峰面积代入回归方程计算，RSD值分别为1.42%、1.83%、0.60%，表明精密度良好。

2.5 加样回收率试验

精密量取浓度为20 μg/mL的FNZ贮备液适量，分别加入适量的空白SLN，用流动相溶解并定容，得到浓度分别为 1.0、3.0、5.0 μg/mL 的溶液，进样 20 μL，将测得的峰面积代入回归方程，计算平均回收率为98.56%，RSD值为1.76。

2.6 盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒包封率的测定

2.6.1 透析法

精密吸取盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒混悬液2.0 mL，置透析袋中封口，取蒸馏水28 mL做透析袋外液，室温下透析6 h，达平衡后取透析袋外液2.0 mL定容至5.0 mL容量瓶中，摇匀[6]。精密吸取 20 μL 溶液，进样，按“2.2”项下色谱条件测定游离盐酸氟桂利嗪浓度，计为M1；另精密吸取盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒混悬液1.0 mL，用甲醇破乳并定容至10.0 mL容量瓶中，同法测定盐酸氟桂利嗪总浓度， 计为 M2；计算平均包封率为 76.42%[（M2-M1）/M1×100%]，RSD 值为 1.75%（n=3）。

2.6.2 离心法

（1）精密量取FNZ-SLN混悬液 2.0 mL，15 000 r/min离心30 min，精密量取上清液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，测FNZ的含量C1。（2）精密吸取0.5 mL的FNZ-SLN混悬液，转入5 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，用甲醇定容至刻度，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液测定FNZ的含量C2[7]。离心法包封率计算公式如下：包封率（%）=（1－C1/C2）×100%。 由于载药脂质硬脂酸密度与水相近，离心难度大，即使离心较长时间后，离心管上清液中仍有白色的FNZ-SLN，不能完全将FNZ-SLN沉降至管底，即很难把FNZ-SLN与游离FNZ分离完全，测定结果为 46.37%，RSD 值为 3.26%（n=3）。

2.6.3 葡聚糖凝胶法

2.6.3.1 洗脱曲线的考察 取一定量Sephadex G-50，用30%的乙醇溶胀12 h后，装入到20 cm×1.0 cm的层析柱中，最终得到柱高为（15.0±0.5）cm的葡聚糖凝胶柱。取空白SLN 2 mL上柱，用30%乙醇洗脱，饱和柱子后，再分别精密吸取FNZ-SLN 0.3 mL上柱，用30%乙醇洗脱，流速1.0 mL/min，每2分钟分段收集洗脱液，然后把收集到的洗脱液分别加入到10 mL容量瓶中，先用适量甲醇溶解，后用甲醇定容，取20 μL进样测定，记录色谱图，代入线性回归方程算出浓度，做洗脱曲线[7-8]，如图1。结果表明，葡聚糖凝胶柱可将FNZ-SLN和游离药物完全分开，即此法适合本实验的要求，所以选用葡聚糖凝胶法作为包封率的测定方法。

图1 FNZ-SLN在Sephadex G-50中的洗脱曲线

2.6.3.2 柱回收率测定 以蒸馏水与30%乙醇溶液作为洗脱液，洗脱饱和过的柱子的回收率为（93.60±1.85）%。

2.6.3.3 包封率的测定 精密吸取空白固体脂质纳米粒混悬液1.0 mL上柱，饱和柱子后，分别精密吸取三批盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒混悬液0.3 mL，按“2.6.3.2”项下方法进行试验，测定游离药物浓度；另精密吸取含药固体脂质纳米粒混悬液1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。按“2.2”项下色谱条件测定总药物浓度，计算包封率。结果见表1。可以知葡聚糖凝胶法的包封率为（79.20±1.27）%，RSD 值为 1.61%。 由此可以看出 FNZ-SLN使用葡聚糖凝胶法测定包封率时，结果RSD值较小，说明该方法较精密，由图1看出该法的分离度也较好，所以葡聚糖凝胶法比较适合盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒和其游离药物的分离。3结论

表1 FNZ-SLN包封率测定结果（n=3）

通过比较透析法、离心法和葡聚糖凝胶法这三种方法，最终选定葡聚糖凝胶法作为盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒与其游离药物的适宜分离方法，该法相对于离心法对仪器设备的要求较低，且分离效果较好，相对于透析法则耗时较短且测定的结果较准确。所以对于盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒来说，葡聚糖凝胶法是适宜的包封率测定方法，用该方法测得其包封率为（79.20±1.27）%。

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