经选择的肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因发生率的研究

孟丽娟 王峻 樊卫飞 蒲骁麟 王琳 刘福银 杨民

EML4-ALK融合基因是非小细胞肺癌(NSCLC)中最新发现的一种癌基因，该融合基因的发现及相关研究是2009年NSCLC的10大事件之一。EML4-ALK融合基因可导致肿瘤基因ALK结构激活，现已是新的NSCLC诊断标志和治疗靶标。本文比较了不吸烟或少吸烟的EGFR野生型和EGFR状态未明2组肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因检测的阳性率，以探讨结合临床特征和分子事件筛选检测人群的可行性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂 DNA提取试剂盒(天根生物有限公司)，TaqDNA聚合酶、PCR引物、PCR产物纯化回收试剂盒(上海生物工程有限公司);ALK基因断裂重组试剂盒(北京金菩嘉有限公司)。

1.2 研究对象 选择2010年1月至2012年10月在我院住院及门诊就诊的新诊断的肺腺癌患者。入组对象需同时符合以下2点:(1)经病理确诊为NSCLC;(2)不吸烟或少吸烟者。共100例，男56例，女44例，年龄34～72岁，平均(57.1±3.1)岁。根据EGFR状态分为EGFR野生型组和EGFR状态未知组。EGFR野生型组50例，其中男29例(58%)，女21例(42%);年龄34～72岁，平均(57.3±3.4)岁，＜60岁者28例(56%)，≥60岁者22例(44%);临床分期Ⅰ期5例(10%)，Ⅱ期18例(36%)，Ⅲ期27例(54%)。EGFR状态未知组50例，其中男27例(54%)，女23例(46%);年龄35～70岁，平均(56.5±2.7)岁，＜60岁者29例(58%)，≥60岁者21例(42%);临床分期Ⅰ期 4例(8%)，Ⅱ期 17例(34%)，Ⅲ期 29例(58%)。2组在性别、年龄及疾病分期方面差异无统计学意义，具有可比性。

1.3 实验方法

1.3.1 直接测序检测EGFR突变

1.3.1.1 石蜡标本DNA提取:(1)石蜡标本按10～15 μm切片。切片刮取包埋组织若干，置1.5 ml EP管，加二甲苯1200 μl震荡混匀，55～60℃温育2～3 h进行脱蜡处理;(2)8000 r/min离心10 min，去除二甲苯;(3)加 无 水 乙 醇 1200μl，震 荡 混 匀，10 000 r/min离心5 min后吸弃乙醇。(4)37℃烤箱干燥30 min，55℃过夜消化后按基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作。

1.3.1.2 引物设计及合成:EGFR 18～21号外显子引物序列见下表，所有引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，详见表1。

表1 EGFR外显子引物序列

1.3.1.3 巢氏PCR扩增:石蜡标本提取全基因组DNA应用巢氏PCR进行2轮扩增。巢氏PCR第1轮扩增体系:PCR反应体系总体积为25 μl，包括:基因组DNA 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 1F 1 μl，Primer 1R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。巢氏PCR第2轮扩增体系:第1轮扩增产物 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 2F 1 μl，Primer 2R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR 扩增反应条件:EGFR 基因第1轮扩增反应条件:初始变性(95℃，5 min);30个循环:变性(94℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最终延伸(72℃，10 min)。EGFR基因第2轮扩增反应条件:初始变性(95℃，5 min);35个循环:变性(94℃，30 s)，退火(60℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最终延伸(72℃，10 min)。

1.3.1.4 PCR扩增产物DNA测序及突变解读:PCR扩增产物经凝胶电泳证实后，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成DNA测序。运用CIIROMAS软件解读基因测序图形。运用The Basic Local AI ignment Search Tool(BLAST)将DNA序列与标准野生型DNA序列进行比较，找出变异位点，若在所检测的核苷酸的相对应位点发现有变异，则可能为基因突变。突变的最终确定需要肉眼对DNA图形进行确认。

1.3.2 FISH法检测EML4-ALK融合基因

1.3.2.1 操作步骤:石蜡标本按4 μm切片。按下述步骤操作:(1)56℃，烤片3～5 min;(2)室温，松节油10 min 2次;(3)室温，100%乙醇5 min;(4)室温，100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2 min;(5)室温，去离子水3 min，用无线纸巾吸取多余的水分;(6)50℃，酸性亚硫酸钠30 min;(7)37℃，蛋白酶K 10～30 min［取0.4 ml蛋白酶K储存液(20 mg/ml)溶于40 ml 2×SSC(pH 7.0)得到蛋白酶 K工作液(200 μg/ml)］;(8)室温，2×SSC 5 min 2次;(9)室温，70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各3 min;(10)自然干燥玻片;(11)56℃，烤片2～5 min;(12)探针准备:杂交液8 μl和探针 2 μl加入到 0.5 ml离心管中混匀，离心1～3 s，备用。(13)将10 μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边;(14)准备杂交仪器，共变性条件，83℃ 7 min，杂交条件，42℃ 16 h;(15)46℃，2×SSC 5 min;(16)46℃，0.1%NP-40/2×SSC 5 min;(17)室温，70%乙醇3 min后于暗处自然风干玻片;(18)室温，将15μl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15 min后观察。

1.3.2.2 FISH结果判断标准:绿色探针示ALK基因5'端，红色探针示ALK基因3'端。两者融合为黄色，表示ALK基因未发生重排，即无EML4-ALK融合基因;两者分离表示ALK基因发生重排，即存在EML4-ALK融合基因。计数100个细胞，其中异常细胞≥20%为阳性，＜20%则为阴性。

1.4 统计学分析 应用统计软件SPSS 20.0进行数据处理。率的比较采用卡方检验，双侧检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EML4-ALK融合基因发生率 EGFR野生型组有15例EML4-ALK融合基因阳性(15/50，30%);EGFR状态未知组有4例EML4-ALK融合基因阳性(4/50，8%)，2组比较有显著性差异(P＜0.05)。FISH阴性结果见图1，阳性结果见图2。

2.2 EML4-ALK融合基因阳性患者临床特征 100例患者中，EML4-ALK融合基因发生率与年龄、性别、肿瘤分期无明显相关性(P＞0.05)，见表2。

3 讨论

全球肺癌每年平均新发病例数超过160万，其中85%为NSCLC，＞50%的NSCLC患者在初诊时已是晚期［1］。在肺癌发病率迅速增长的同时，肺癌的构成比例也发生着重要变化，鳞癌比例下降，腺癌比例上升，已成为NSCLC中最常见的病理类型。2011年，国际肺癌研究协会(IASLC)、美国胸科学会(ATS)及欧洲呼吸学会(ERS)联合颁布了肺腺癌的国际多学科分类新标准。新标准要求进一步细化诊断，重视重要分子事件如EGFR突变、K-RAS突变、EML4-ALK融合基因等。次年，《2012非小细胞肺癌NCCN指南》作出了重要修订，明确了FISH为EML4-ALK融合基因检测的金标准。不同的分子事件需要不同的治疗方法，比如:EGFR突变、K-RAS野生型的患者首选表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)［2］;EML4-ALK融合基因阳性的患者则不能从EGFR-TKI治疗中获益，目前针对EML4-ALK融合基因的靶向药物正在临床研究中。

2007年日本学者Soda等［3］首次在NSCLC患者术后标本中检测到EML4-ALK融合基因。此后，美国、日本、韩国及中国香港均有报道［4-6］。检测EML4-ALK融合基因有切实的临床意义。最近一项开放、多中心参与的Ⅱ期临床试验中，82例EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者口服crizotinib(ALK及c-Met基因的共同抑制剂)后，总体有效率为57%(47/82)，8周疾病控制率为87%［7］。可见，针对 ALK的靶向治疗成为治疗EML4-ALK融合基因阳性患者的一种重要方法。

然而，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中阳性检出率较低，仅约1.5% ～6.7%。Shaw等［8］为了提高该融合基因的检出率，设定入组患者必须具备2种或更多的下列临床特征:女性、亚裔、无或仅少量吸烟史、腺癌。结果显示该融合基因的阳性率可提高到13%(19/141)，如果不吸烟或仅少量吸烟者和(或)不伴有EGFR突变者，其阳性率分别高达22%和33%。Sasaki等［6］统计了8个包括亚洲人、欧洲人的大样本临床研究，共1276例，不吸烟或轻度吸烟的NSCLC患者中EMIA-ALK表达阳性率为9.4%，而在吸烟的NSCLC患者中，阳性率只有2.9%。EGFR和KRAS基因均为野生型的高加索肺腺癌患者中ALK融合基因阳性率(FISH法)高达30%以上，而EGFR和KRAS基因均为野生型的中国肺腺癌患者中ALK融合基因阳性率(RACE——coupled PCR 法)却达到了 42.8%［6］。这提示我们，经筛选的病例可显著提高EML4-ALK融合基因的阳性率。本研究显示经病理确诊的不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，EGFR野生型组EML4-ALK融合基因阳性率达30%，而EGFR状态未明组EML4-ALK融合基因阳性仅8%，2组差异有显著性。EML4-ALK融合基因发生率与年龄、性别、临床分期无明显相关性。阳性率小于国内报道值(40%)，可能与筛选方案不同及检测方法不同有关。Zhang等［9］的研究同时检测了EGFR和K-RAS状态，要求两者均为野生型，EML4-ALK融合基因采用的是RACE——coupled PCR法;本研究仅要求EGFR为野生型，同时采用的FISH法检测EML4-ALK融合基因。本研究显示在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者中，经EGFR基因状态筛选可提高ML4-ALK融合基因检测阳性率。由于本研究样本量偏小，结果仍有待大规模的研究进一步佐证。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer Statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

［2］刘福银，王峻，樊卫飞，等.吉非替尼治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床研究［J］.实用老年医学，2009，23(5)370-372.

［3］Soda M，Choi YL，Enomoto M，et al.Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer［J］.Nature，2007，448(7153):561-566.

［4］Wong DW，Leung EL，So KK，et al.The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS ［J］.Cancer，2009，115(8):1723-1733.

［5］Choi YL，Takeuchi K，Soda M，et al.Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lungcancer ［J］.CancerRes，2008，68(13):4971-4976.

［6］Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al.The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46(10):1773-1780.

［7］Kwak EL，Bang YJ，Camidge DR，et al.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer［J］.N Engl J Med，2010，363(18):1693-1703.

［8］Shaw AT，Yeap BY，Mino-Kenudson M，et al.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK［J］.J Clin Oncol，2009，27(26):4247-4253.

［9］Zhang X，Zhang S，Yang X，et al.Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression［J］.Mol Cancer，2010，9(9):188-199.