黄芪甲苷单克隆抗体的制备及鉴定

于生兰，欧阳臻 ，徐加兵，王帅兵

1江苏大学食品与生物工程学院，镇江212013;2江苏农牧科技职业学院，泰州225300;3江苏大学药学院，镇江212013

黄芪甲苷(AstragalosideⅣ，简称AST)是中药黄芪药理活性的主要物质之一，为黄芪及其制剂质量鉴定的指标成分。药理研究表明:AST具有调节机体免疫力、保护组织器官、降低血糖、抗细胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常广阔的发展前景［1］。目前检测AST的方法有高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法(TLCS)、比色法、荧光法等，但这些方法或者操作复杂，灵敏度低，或者分析成本高，耗时长。基于抗原抗体反应的酶联免疫检测(ELISA)是一种新型的分析方法，可以有效解决传统方法所存在的问题。本实验采用人工合成的方法制得AST与牛血清白蛋白(BSA)的免疫抗原(ASTBSA)，通过细胞融合制备McAb。旨在为ELISA法检测中药黄芪及其制剂中黄芪甲苷的含量奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

AST标准品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)均来自Sigma公司;羊抗鼠酶标抗体，武汉博士德生物有限公司;Balb/c小鼠，雌性，体重16～18 g，扬州大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(苏)2012-0004。

1．2 仪器

CO2培养箱(NUAIRE);MALDI-TOF/TOF质谱仪(Applied Biosystem，4800型);普通、高速离心机(Labnet);超低温冰箱(Heto);生物显微镜(OLYMPUS);酶标仪(BIO2TEK);微量移液器。

1．3 方法

1．3．1 AST-BSA人工抗原的合成与鉴定

1．3．1．1 AST-BSA 人工抗原的合成

将AST的甲醇溶液(浓度为8 mg/mL)逐滴加入NaIO4溶液内(浓度为12．5 mg/mL)，搅拌1 h后，再慢慢加入含有BSA的50 mmol/L(pH 9．6)的碳酸缓冲液(BSA 10 mg溶于碳酸缓冲液2．8 mL)，用1 mol/L的Na2CO3调整反应混合液的pH值至9．0，于室温下搅拌6 h后，将反应液对蒸馏水透析3 d，再经冻干处理，即得到AST-BSA复合物［2］。

AST-OVA采用同样的方法合成。

1．3．1．2 AST-BSA 人工抗原的鉴定(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法)

经ZipTip C4脱盐处理后取1μL蛋白样品点至样品靶上，自然干燥后，再取0．6μL SA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。

在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试。标准物质校准范围为:39212±100、66430±100。在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。根据分子量测定结果，计算偶联比。

偶联比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST［3］

1．3．2 分泌抗AST杂交瘤细胞株的建立［4］

以50μg AST-BSA(溶于150μL PBS)与完全福氏佐剂1∶1混匀成乳液，腹腔注射Balb/C小鼠(3只，6周龄)，间隔2周，腹腔注射交联抗原AST-BSA(与第一次比例相同，弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂)，追加免疫3次，2周后，末次加强免疫。3d后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。SP2/0细胞(1×107)与免疫鼠脾细胞(1×108)按1∶10的比例混合，加入 0．5 mL 50%PEG-4000进行融合。融合后细胞转入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，于37℃，5%CO2培养箱中培养;3 d后，加入HAT培养基进行选择培养。用间接酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用有限稀释法，接种于96孔培养板内，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。

1．3．3 单克隆抗体的大量制备与鉴定

取12周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡(每只0．4 mL)。1周后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显隆起时(注射后约10 d)收集腹水，2000 rpm离心10 min，吸取上清分装，-20℃冻存。采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水，腹水效价测定用间接ELISA方法［5］。

1．3．4 单克隆抗体的特异性检测

用间接竞争ELISA法检测抗体特异性［6］，包被抗原为AST-OVA。根据OD450判定所产生的抗体的特异性。

2 结果与分析

2．1 人工抗原AST-BSA偶联比的确定

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱结果见图1(A)、(B)。测定结果表明:BSA分子量为66446．4766;AST-BSA偶联物分子量为76970．9609，计算出其偶联比为(76970．9609-66446．4766)/784．97≈13。

2．2 单克隆杂交瘤细胞株的制备与鉴定

取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合后共接种5块板，其中10孔加对照细胞(骨髓瘤细胞)，故融合细胞接种孔数为470个，培养后有杂交瘤细胞克隆生长孔数目为325孔，融合率为69．2%。第1次用间接ELISA法筛选，获得阳性孔为94孔，故第1次筛选的阳性率为20．0%。

将获得的94孔杂交瘤细胞再进行亚克隆，并经过ELISA筛选和鉴定，获得了23个阳性杂交细胞亚克隆细胞株。对杂交瘤细胞培养的上清液进行间接ELISA检测，取效价高且特异性强的阳性孔杂交瘤，采用有限稀释法进行克隆，经过3次亚克隆和筛选，最后获得了2株能稳定分泌抗AST单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1D5、3D11(细胞培养见图2)。

3 讨论

3．1 人工抗原的合成与鉴定

作为一个完全抗原必须同时具备T细胞和B细胞表位。小分子物质由于分子太小一般难以同时拥有两个表位，必须将其连接到一些大分子蛋白载体以形成偶联物，借助大分子T细胞表位间接诱导B细胞激活、分化增殖，产生针对半抗原的特异性抗体［7］。AST是一种含糖半抗原，对于半抗原与载体的偶联，传统的人工抗原的合成方法有混合酸酐法、活泼酯法、碳二亚胺法及高碘酸钠法。本实验参考人参皂苷单克隆抗体的制备采用高碘酸钠法［2］，结果表明合成效率较高，合成方法简便可行。

3．2 动物免疫实验

本实验制备单克隆抗体的目的是为了建立中药黄芪及其制剂中黄芪甲苷的ELISA检测方法，要求单克隆抗体有较高的亲和力，所以选择了皮下注射与腹腔注射相结合，并制定了小剂量、长周期、多次数的免疫方案，使得含黄芪甲苷的抗原分子产生了很强的免疫原性。小鼠免疫间隔时间为2周，融合前3 d不加佐剂直接用AST-BSA进行强化免疫，其目的是促进小鼠脾脏内正处于增殖状态的B淋巴细胞数量达到最多。结果表明，选择的实验动物个体、数量及其免疫方案是可行的，免疫效果理想。

3．3 间接ELISA方法建立

本实验对间接ELISA反应条件进行了探索，建立了灵敏、特异、操作简单、适于大批量含黄芪甲苷成分含量的检测方法，为黄芪药材及其制剂中黄芪甲苷的免疫检测方法奠定了基础。作者下一步将对建立的检测方法的灵敏度、交叉反应等进行研究，为以后研制适合黄芪甲苷的检测试剂盒奠定基础。

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