肠炎宁片高效液相色谱指纹图谱研究

邢占芬，成洪达，张平平

山东万杰医学院药学系，淄博 255213

肠炎宁片由地锦草、金毛耳草、香薷、枫香树叶、樟树根五味中药材组成，具有清热利湿、行气的功效，用于急、慢性胃肠炎，腹泻，细菌性痢疾，小儿消化不良等症［1］。经文献查阅，目前肠炎宁片的质量控制仅采用高效液相色谱法测定单一有效成分如没食子酸、鸡屎藤苷甲酯含量［2，3］，由于中药复方化学成份繁多，药效复杂，仅以某种有效成份含量作为质量控制指标是不全面的。本实验采用HPLC对肠炎宁片指纹图谱进行了研究，以达到全面控制其质量的目的。

1 仪器与试剂

大连依利特P1201型高效液相色谱仪(UV检测器1台，高压恒流泵2台，柱温箱，EC2006工作站);上海精密科学仪器有限公司FA1004N型电子天平;天津奥特赛恩斯仪器有限公司AS3120型超声清洗机。甲醇为色谱纯，水为超纯水，槲皮素对照品购自中国药品生物制品鉴定所，11批肠炎宁片购自江西天施康弋阳制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取槲皮素对照品适量，精密称取9.7 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度。

2.2 供试液的制备

取肠炎宁片6片，研细混匀，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，称重，超声提取30 min，放冷，加入甲醇补足失重。摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件

Hypersil BDS色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相以甲醇(A)-水(B)进行梯度洗脱，0～55 min，A:2% ～100%，55 ～62，A:100%，流速 1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样体积20 μL。

2.4 精密度试验

取同一供试品(批号110746)溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性，结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于2.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，进样精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.5 稳定性试验

取同一供试品(批号110746)溶液，分别于0、2、4、6、24、48 h进样，在相同色谱条件下记录色谱图，结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，供试品溶液在48 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批次的供试品(批号110746)溶液5份，按上述色谱条件进行测定，结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，重复性良好。

3 肠炎宁片指纹图谱的建立及分析

3.1 肠炎宁片指纹图谱的建立

按上述方法检测11批肠炎宁片的指纹图谱，见图1，11批样品共获得21个共有峰。

以槲皮素(18号峰)为参照，将其保留时间定为1，计算各峰的相对保留时间，数据见表1。

表1 11批肠炎宁片共有峰相对保留时间Table 1 Relative retention time of common-peak of 11 batches Changyanning tablets

3.2 指纹图谱相似度评价

应用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)”对11批肠炎宁片进行质量评价。将11批样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)”，以批号110746的肠炎宁片图谱为参照谱，生成肠炎宁片共有模式的对照指纹图谱(见图2)，得出11批样品谱图与对照谱图的相似度数据(见表2)，以均值法计算相似度均在0.95以上，符合指纹图谱技术要求，结果见表3。

表2 11批次的肠炎宁片相似度计算Table 2 The calculation of similarity of 11 batches Changyanning tablets

表3 11批肠炎宁片相似度数据Table 3 Similarity of 11 batches Changyanning tablets

4 讨论

4.1 提取方法的考察

本实验分别采用甲醇、50%甲醇-水作溶剂进行超声提取，结果表明，用甲醇做提取溶剂，色谱图包含的色谱峰较多，色谱峰分离较好，故选用甲醇作为提取溶剂。

4.2 色谱柱的考察

考察了供试液在同规格Hypersil ODS C18色谱柱和Hypersil BDS C18色谱柱上的分离情况，两种色谱柱分离结果差异较大，Hypersil ODS C18色谱柱分离情况较差，Hypersil BDS C18色谱柱色谱图基线平稳，出峰较多且分离度好，故选用Hypersil BDS C18色谱柱，色谱柱规格4.6 mm ×250 mm，粒径5 μm。

4.3 流动相的考察

比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液流动相系统，结果表明，甲醇-水体系分离的效果较好。经比较洗脱条件，最终确定采用甲醇(A)-水(B)体系梯度洗脱。

4.4 检测波长的选择

结合文献对地锦草、香薷研究所使用的检测波长(分别 269、345 nm)［4-7］，在200 ～ 360 nm 波段内依次对样品进行 230、254、269、300、345、365 nm 六个波长的特征谱图分析，综合考察色谱峰数及响应值，样品在254 nm下指纹图谱色谱峰数较多，色谱峰分布均匀，各指纹峰均有较大吸收，能全面反映样品成分的信息特征，因此，确定试验检测波长为254 nm。

中药复方由多味药材组成，化学成分繁多，其多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础，同时也是质量评价的难点与重点。目前，大量中药仅以某种或几种有效成份含量作为质量控制指标，方法简单、单一，无法真正体现中药的整体特征及内在质量。

本实验建立了肠炎宁片HPLC指纹图谱，确定了21个共有峰，共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均在3%以内，利用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”计算指纹图谱的相似度，结果均在0.95以上，所建立的方法稳定、可靠，可用于肠炎宁片的质量评价。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，71.

2 Li J(李晶)，Li CT(李才堂)，Zhou GP(周国平)，et al.Quality standard of Changyanning tablet.Chin J New Drugs(中国新药杂志)，2010，19:68.

3 Yu DF(余德发)，Wang ZQ(王志琴)，Cao JG(曹建国)，et al.Determination of kaempferide in Changyanning tablets by HPLC.J Jiangxi Univ Tradit Chin Med(江西中医学院学报)，2003，15(2):56.

4 Chen GS(陈根顺)，Li P(李鹏)，Xu LF(徐丽芳).Study on fingerprints on Chinese Mosla Herb by HPLC.Changyanning tablets.Chin Arch Tradit Chin Med(中华中医药学刊)，2009，27:772.

5 Tan XF(谭秀芳)，Li XJ(李晓瑾)，Wang Q(王强)，et al.HPLC fingerprint spectrum of Uighur Herba Euphorbiae Humifusae.Chin Wild Plant Res(中国野生植物资源)，2011，30(3):47.

6 Li P(李萍).HPLC for content measurement of quercetin in Hedyotis chrysoticha.J Guang Dong Coll Pharm(广东药学院学报)，2006，2:57.

7 Ji L(吉力)，Wang F(汪芳)，Liu YY(刘元艳).Determination of carvacrol and thymol in Mosla chinensis by HPLC.Chin J New Drugs(中国新药杂志)，2004，29:1030.