TLR7、TLR8在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义!

马海丽， 刘 建， 逯清丽

华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科，武汉 430030

肺癌是导致人类死亡的主要疾病之一，虽然近年来在肺癌的临床治疗方面有很大的进展，但肺癌的5年生存率仍相对较低，为5%。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）最早发现于果蝇体内，是一类模式识别受体，识别病原和损伤相关分子模式，在启动天然免疫应答的同时，也参与激活特异性免疫应答，在宿主免疫防御中起着重要作用。近来研究表明，TLRs在肿瘤形成、免疫治疗方面起着一定的作用。TLR7、TLR8作为TLRs的成员，主要识别单链RNA，参与病毒感染［1－2］。对其和肺癌的关系目前研究尚少。本研究采用免疫组化方法，检测TLR7、TLR8在非小细胞肺癌中的表达，分析其与肺癌临床病理特征之间的关系，初步探讨TLR7、TLR8在非小细胞肺癌中的作用，为进一步研究TLR7、TLR8在肺癌中的治疗应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

随机选取2010～2011年华中科技大学同济医学院病理学系保存的43例非小细胞肺癌及其中20例的癌旁正常肺组织标本（距离肿瘤边缘5cm以上）。所有患者在手术之前均未接收放疗或化疗，排除慢性阻塞性肺疾病、肺炎等呼吸系统疾病，并且具有完整的病理资料。所有标本均经病理检查证实为非小细胞肺癌或癌旁正常肺组织。患者平均年龄为54.4岁，男性患者34例，女性患者9例。其中鳞癌21例，腺癌22例；分化程度为高中分化27例，低分化16例；依据国际抗癌联盟UICC肺癌TNM分期（2009年版）分为Ⅰ期12例，Ⅱ期8例，Ⅲ期22例，Ⅳ期1例；淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者20例。

1.2 主要试剂

兔抗人TLR7单克隆抗体、小鼠抗人TLR8多克隆抗体均购于启动子生物有限公司。过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）通用型试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司。苏木精染液购于武汉谷歌生物有限公司。

1.3 实验方法

采用免疫组化SP三步法。所有蜡块均连续4 μm切片，切片置于60℃恒温烤箱中20min，脱蜡水化。PBS冲洗后，3%H2O2室温孵育30min，PBS冲洗，进行微波抗原修复20min，PBS冲洗后，正常山羊血清室温封闭20min左右。加入兔抗人TLR7抗体（1∶50稀释），鼠抗人TLR8抗体（1∶100稀释）一抗后，置于4℃冰箱中孵育过夜。次日取出复温45min后，加入生物素标记的二抗和辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色后，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定

根据文献［3］标准，TLR7、TLR8以细胞质中出现棕黄色或棕褐色着色为阳性，400倍光镜下计数，免疫组化结果依阳性细胞数和染色强度进行综合判定。阳性细胞数计分，依阳性细胞率≤10%、11%～、26%～、51%～、＞75%分别记为0～4分；染色强度记分，依无着色、浅棕黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0～3分。二者得分相乘，大于等于平均分者为阳性表达，小于者判为阴性表达。

1.5 统计学分析

应用SPSS 12.0统计分析软件，对实验结果进行卡方检验及Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR7、TLR8在非小细胞肺癌组织及正常肺组织中的表达

TLR7、TLR8的阳性表达主要以细胞质中出现棕黄色或棕褐色着色为标准。TLR7主要表达在肺癌细胞核周围（图1），在非小细胞肺癌组织中的阳性表达为48.8%（21／43），高于癌旁正常肺组织（3／20，15.0%），差异具有统计学意义 （P＜0.05）。TLR8表达在肺癌细胞的细胞质中（图2），相对TLR7，表达分布弥散，在非小细胞肺癌中的阳性表达为69.8%（30／43），高于癌旁正常肺组织（4／20，20.0%），差异具有统计学意义（P＜0.05）。正常肺组织中，TLR7和TLR8在正常肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞中有少量表达（图3）。

图1 TLR7在肺腺癌（A）和肺鳞癌（B）中的表达（DAB显色，×400）Fig.1 The expression of TLR7in lung adenocarcinoma（A）and squamous cell carcinoma（B）（DAB，×400）

图2 TLR8在肺腺癌（A）和肺鳞癌（B）中的表达（DAB显色，×400）Fig.2 The expression of TLR8in lung adenocarcinoma（A）and squamous cell carcinoma（B） （DAB，×400）

图3 TLR7（A）、TLR8（B）在正常肺组织中的表达（DAB显色，×400）Fig.3 The expression of TLR7（A）and TLR8（B）in the normal lung tissue（DAB，×400）

2.2 TLR7、TLR8表达与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系

TLR7的表达与性别和病理类型有关，与吸烟、年龄、淋巴结转移、TNM分期、分化程度无相关性。TLR8的表达与吸烟有关，但与年龄、性别、病理类型、淋巴结转移、TNM分期、分化程度等无相关性（表1）。

表1 TLR7、TLR8与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系Table 1 The relationship between expressions of TLR7and TLR8and clinicopathologic features of NSCLC tissues

2.3 非小细胞肺癌中TLR7和TLR8表达的相关性

TLR7和TLR8在43例非小细胞肺癌组织中的表达，均阳性的16例，均阴性的8例，TLR8阳性而TLR7阴性的14例，TLR8阴性而TLR7阳性的5例，Pearson相关分析结果表明，TLR7、TLR8在肺癌中的表达无相关性（P＝0.382）。

3 讨论

Toll基因最早发现于果蝇体内，编码Toll蛋白。人们发现Toll及Toll信号传导通路有助于果蝇对抗感染过程，其主要作为受体抵抗真菌感染［4］。后来人们相继在植物、动物、人类体内发现了类似果蝇体内Toll的受体及其信号通路，因此，此类受体被称为 Toll-like receptors（TLRs）。目前在人类体内至少发现10个TLR家族成员。TLRs胞外富含亮氨酸重复片段，以识别配体，各个TLR家族成员识别的病原成分不同。TLRs识别病原（体外）和损伤（体内）相关分子模式，前者包括细菌、病毒、真菌等病原，后者主要是体内炎症、损伤信号。TLRs信号途径释放NF-κB、IFN-α等一系列因子，上调抗原递呈细胞表面的共刺激分子表达，启动天然免疫应答，激活非特异性免疫应答［5－7］，参与机体免疫防御过程。TLR7、TLR8作为TLRs家族成员，两者具有相似的结构［8］，其主要定位表达于细胞质内，TLR7主要表达于抗原提呈细胞（包括CD34＋树突状细胞），TLR8主要表达于单核细胞、巨噬细胞、及髓系树突状细胞［9］。其配体包括天然配体和人工合成的化合物两种。前者是病毒复制过程中产生的单链RNA，介导病毒感染过程；后者包括人工合成的RNA片段及咪唑喹啉胺类等。咪喹莫特作为一类重要的咪唑喹啉胺类成员，已应用于临床病毒感染及某些皮肤肿瘤的局部免疫治疗［10］。

有研究表明，TLRs不仅在免疫细胞表达，其在肿瘤细胞上也存在表达。TLR信号传导通路启动NF-κB、MAPK信号通路，释放炎症因子，在炎症、肿瘤的形成、发展过程中起着重要作用。有研究发现，TLRs表达的增加，一定程度上和食管癌等肿瘤的发生、发展有关［3，11］。Ochi等［12］发现 TLR7在人和小鼠的胰腺癌组织中表达增加，经其配体刺激后，上调p53、c-Myc、TGF-β等基因的表达，明显加速肿瘤进展。Cherfils-Vicini等［13］用相应配体刺激肺癌细胞株上的TLR7和TLR8后，观察到NF－κB激活，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达上调。TLR家族成员TLR4和TLR9也被发现在肺癌组织中存在高表达［14］。同时，有研究发现相对于正常肺组织，在非小细胞肺癌细胞中TLR7mRNA水平明显增加［15］。这些研究提示TLRs可能与肿瘤的发生、发展密切相关。

目前对于TLR7和TLR8在肺癌组织中的表达研究尚少。本研究采用免疫组化方法检测了TLR7和TLR8在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的蛋白质表达水平，结果显示TLR7在鳞癌及腺癌中的阳性表达率为48.8%，TLR8阳性表达率为69.8% ，两者均高于癌旁正常肺组织，这与Cherfils-Vicini等［13］的结果是一致的。本研究显示，TLR7在腺癌组织中的阳性表达率为72.7%，高于鳞癌组织中的阳性表达率23.8%，两者之间差异具有统计学意义，表明TLR7在非小细胞肺癌的表达与病理类型有关。同时发现女性肺癌患者的TLR7表达阳性率高于男性肺癌患者，这可能与腺癌女性多发有关。有吸烟史的肺癌患者癌组织中TLR8阳性表达率高于无吸烟史者，提示吸烟可能是影响TLR8参与肺癌进程的一个危险因素。本研究未发现TLR7、TLR8的表达与肺癌分化程度、病理分期、淋巴结转移之间的相关性，可能与样本例数较少有关，因此需进行更大样本量的研究。在TLRs家族中，TLR7和TLR8有着相似的结构，本研究未发现两者之间有相关性，推测两者可能在肺癌发展过程中没有协同作用。

总之，TLRs与其相应配体结合后，释放一系列的炎症、细胞因子，参与肿瘤形成、发展过程，TLR7和TLR8在非小细胞肺癌细胞中高表达，提示两者参与肺癌发病过程，其具体机制及信号通路尚需进一步研究。

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