荸荠皮中总黄酮物质的提取及其抑菌作用研究

许国权，郭艳华

（江汉大学 a.生命科学学院； b.化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056）

荸荠（Eleochairis tuberosa），俗名马蹄（water chestnut），是莎草科荸荠属多年水生草本植物的地下球茎，是一种常见的天然经济作物，自古有地下雪梨之美誉。目前，我国荸荠的栽培面积约为2.7万hm2，产量占世界的95%以上，长江流域以南各省均有分布。荸荠作为一种优良的药食同源果蔬食物，多被用来作为食品进行深加工，加工过程中产生了大量的荸荠皮，其质量占鲜荸荠质量的20%～25%。荸荠皮中含有抗菌成分荸荠英，对多种细菌均有不同程度的的抑制作用，其主要成分为酚类、生物碱、有机酸、皂苷及游离黄酮类等成分，荸荠皮中还含有丰富的水溶性棕色素和膳食纤维［1-2］。通过不同的提取条件，采用不同的提取溶剂可以将荸荠皮中不同的成分进行提取，并加以利用，可以为处理废弃物提供一条新的途径。国内外对荸荠皮的提取工艺和提取物应用的研究有些报道［3-10］，已证明荸荠皮提取物中黄酮类物质有很好的生理活性和药理作用，学者们对荸荠皮的提取工艺也进行了一些探讨。

笔者在此基础上对荸荠皮提取物中总黄酮的含量以及抑菌效果进行了研究，相关研究至今未见文献报道。通过对多种细菌的抑菌试验探讨总黄酮含量与抑菌效果的关系，这对深层次研究荸荠皮中不同的化学成分与抑菌作用间的关系具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

荸荠（武汉市某大型超市购得，孝感产），将荸荠皮自然凉干或在电热鼓风干燥箱CS101-2A（重庆试验设备厂）（45℃以下）烘干，用粉碎机粉碎备用。

1.2 主要仪器

旋转蒸发器RE-2000A（上海亚荣生化仪器厂），循环水式多用真空泵SHB-ⅢA（上海豫康科教仪器设备有限公司），微型植物粉碎机FZ102（天津市泰斯特仪器有限公司），电热真空干燥箱2K-60AB（上海申光仪器有限公司），恒温培养箱DHP120（上海实验仪器厂有限公司），电子天平JA5003B（上海越平科学仪器有限公司），超净工作台SHJ-875（上海实验仪器厂有限公司），立式压力蒸气灭菌器YXQ-LS-50S11（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），恒温培养振荡器HNY-100B（天津市欧诺仪器仪表有限公司），数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）、电热真空干燥箱ZKF030（上海实验仪器厂有限公司），752分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.3 试剂及用品

乙酸、乙醇、盐酸、氢氧化钠、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、医用酒精，以上试剂均为分析纯。

实验菌种：大肠埃希菌（Eschercihia Coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均从华中农业大学购得。

1.4 试验方法与过程

1.4.1 标准溶液与样品溶液的制备 准确称取105℃下烘至恒重的芦丁标准样品20.00 mg，用30%乙醇溶解并定容至100 mL，摇匀，得浓度为0.200 mg/mL的芦丁标准溶液。

称取若干份10.000 g荸荠皮粉按照不同料液比（g/mL）分别加入75%乙酸溶液中，在不同温度下用恒温水浴锅加热浸提若干小时，用定量滤纸趁热负压抽提过滤，滤渣再加入相应的溶剂二次浸提，再过滤，合并两次所得滤液，得荸荠皮样品溶液（即粗提液），另将粗提液蒸馏得到膏状提取物用30%乙醇溶解配制成0.2 g/mL的溶液备用。

取干荸荠皮均为10.000 g，以提取时间、提取温度、料液比为因素进行L（933）正交试验。进一步确定适宜提取工艺条件。L（933）正交试验：按正交试验3因素水平表（见表1）进行L（933）正交试验，以确定荸荠皮总黄酮物质提取的适宜条件。

表1 正交试验因素水平表

1.4.2 芦丁标准曲线的绘制 准确吸取上述芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5%NaNO20.75 mL，摇匀放置5 min，加10%Al（NO3）30.75 mL摇匀，放置 6 min，加1 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，摇匀，用30%乙醇定容，摇匀，放置10 min后，在510 nm处测吸光度，以吸光度为横坐标，芦丁标准溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程。

1.4.3 样品中总黄酮含量的测定 取各样品粗提液1 mL加到25 mL容量瓶中，加入0.75 mL的5%NaNO2摇匀后放置5 min，加入0.75 mL 10%Al（NO3）3放置6 min，再加入5.0 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容至刻度，摇匀后放置10min，510 nm紫外光下测吸光度，用空白作对照。

式（1）中：C为根据回归方程计算出的稀释后的荸荠皮样品溶液的总黄酮浓度（mg/mL）；V为荸荠皮样品提取粗提液体积（mL）；m为荸荠皮粉样品质量（g）。

1.5 抑菌效果测定方法

滤纸片法测定荸荠皮提取物的抑菌率［11-13］。将蒸馏所得的荸荠皮提取物用30%乙醇制成0.2 g/mL的溶液进行抑菌活性试验。将已灭菌的小圆滤纸片（D 6 mm）浸于荸荠皮提取物中60 min，风干，制成样品滤纸片。用无菌移液器取0.2 mL的试验菌菌悬液分别加到培养皿平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀，在每个平板贴3～4片相同浓度成分的小圆滤纸片，贴完编号；再将上述贴好滤纸的含菌平板倒置放入培养箱中培养，细菌放置在37℃下培养，细菌培养16 h后取出测量抑菌圈的大小，通过多次试验取平均值。

1.6 数据的处理统计分析

用Excel对所得数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线与回归方程

在测量波长510 nm处测定吸光度值，以芦丁浓度—吸光度值作标准曲线，得回归方程：C=0.1001A+0.0004（C为芦丁浓度，单位为mg/mL，A为吸光度），相关系数R2=0.9993；芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取溶剂对总黄酮得率的影响 按照料液比1∶12，在50℃浸提5 h，以蒸馏水、65%乙醇、75%乙醇、75%乙酸、乙醇—乙酸（体积比3∶1）为提取溶剂，从图2可以看出，75%乙酸提取所得总黄酮得率最高，为1.46%，其次是75%乙醇，蒸馏水提取的得率最低，因此，以乙酸作为提取溶剂。

图2 提取溶剂对总黄酮得率的影响

2.2.2 乙酸浓度对总黄酮得率的影响 用36%～80%的乙酸为浸提溶剂在料液比1∶12、温度70℃条件下浸提5 h，从图3可以看出，随着乙酸浓度增加，总黄酮得率也增加，在乙酸浓度达到75%时，总黄酮提取物得率最大，得率达到1.5%，当浓度达到80%时，提取效果反而降低。因此，本试验以75%的乙酸为浸提溶剂。

图3 提取浓度对总黄酮得率的影响

2.2.3 料液比对总黄酮得率的影响 料液比会影响提取溶剂对活性物质的溶解。料液比比值过高，活性物质不能充分溶解，使得提取率降低；料液比比值过低，虽然可以充分溶解活性物质，但是成本较高。因此选择适宜的料液比可以兼顾提取率和成本。从图4可以看出，75%的乙酸在70℃下不同料液比浸提5 h条件下浸提，总黄酮得率在1∶8～1∶12范围内呈上升趋势，在1∶12时达到峰值，为1.50%；但料液比为1∶14时反而低于1∶12时。因此，选择料液比为1∶12为适宜的料液比。

图4 料液比对总黄酮得率的影响

2.2.4 提取温度对总黄酮得率的影响 温度越高，物体分子运动越剧烈，活性物质越容易释放到浸提溶剂中来。75%的乙酸按照料液比1∶12在40～90℃条件下浸提5 h，从图5可以看出，随着提取温度升高，总黄酮得率增加，在40～60℃范围内变化幅度小一些，在60～80℃范围内变化幅度较大，并在80℃时达到峰值，为1.44%，之后呈下降趋势，由于温度过高对黄酮类物质的活性也会有影响，因此选择70℃为适宜提取温度。

图5 提取温度对总黄酮得率的影响

2.2.5 提取时间对总黄酮得率的影响 提取时间影响到溶剂与被提取物充分接触与否，被提取物是否能够被萃取并充分释放出来，当然长时间提取会造成总黄酮物质的分解或转化而使得率降低。用75%的乙酸为浸提溶剂在料液比1∶12、温度70℃条件下提取时间3～8 h。从图6可以看出，提取3～5 h时，得率呈现上升趋势，5 h总黄酮的得率最大，为1.56%，4 h和5 h比较接近，之后总黄酮得率开始下降；因此，选择提取时间以4～5 h为宜。

2.3 提取条件优化试验结果

图6 提取时间对总黄酮得率的影响

根据单因素试验的结果，确定以料液比，提取温度、提取时间等3个因素进行正交试验，结果见表2。由表2的极差分析可知，料液比，提取温度、提取时间3个因素对总黄酮提取量影响的主次顺序为：提取温度＞料液比＞提取时间，从荸荠皮中提取总黄酮的适宜工艺是C2B3A3，即提取温度为70℃、提取时间为6 h、料液比为1∶14，在此条件下，从荸荠皮中提取到总黄酮的得率为1.56%。

2.4 总黄酮提取物对细菌的抑菌效果

2.4.1 不同总黄酮含量的提取物对细菌的抑菌效果 从表3可以看出，提取物对大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌都有很强的抑菌作用，对大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用相当，对铜绿假单胞菌的抑菌作用稍弱；但是从抑菌效果与总黄酮含量的关系来看，总黄酮含量的多少与抑菌效果没有明显相关性，因此可以推断在提取物中起抑菌作用的物质不完全是黄酮类物质。

表2 正交试验结果

表3 不同总黄酮含量的提取物对4种细菌的抑菌效果/mm

2.4.2 不同浸提温度的提取物对细菌的抑菌效果

从表4可以看出，50～80℃下提取所获得的提取物对大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌的抑菌作用没有线性关系。

3 结论

通过正交试验确定了用75%的乙酸从荸荠皮中提取总黄酮类物质的适宜工艺条件：提取温度为70℃、料液比为1∶14，提取时间为6 h，在此条件下，从荸荠皮中提取到总黄酮的得率为1.56%。

表4 不同提取温度所获得提取物对4种细菌的抑菌效果/mm

从荸荠皮中的提取物总黄酮对大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌均有较强的抑菌作用，但是总黄酮含量的多少与抑菌效果没有明显相关性，因此可以推断在提取物中起抑菌作用的物质不仅是黄酮类。50～80℃下浸提所获得的提取物对4种细菌的抑菌作用也没有线性关系。

用乙酸浸提过程中，随着乙酸浓度增大，粗提液的颜色越深，当乙酸浓度达到75%时，粗提液的颜色最深，浓度再升高时颜色反而变浅；随着浸提温度的升高，粗提液的颜色也越来越深，颜色由淡黄色向深褐色变化；提取时间对粗提液的颜色影响不大。这主要是荸荠皮中的黄酮类色素随着提取温度和溶剂浓度的升高被大量提取出来，从正交试验的结果也可以反映出来。

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