关于PCR仪基座温度校准点选择的探讨

方荣瑞

(芜湖市计量测试研究所,芜湖 241007)

0 引言

聚合酶链式反应(PCR)是20世纪80年代中期发展起来的在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术[1]。温度控制作为PCR仪中一个关键技术，它的准确性直接影响到扩增的结果。由于PCR仪基座形状复杂，如图1所示，影响其控温精度和温场分布因素很多[2]。对PCR温度研究都是通过各个单点出发，通过比较特征点温度与设定值的差异来评估仪器控温精度，对比特征值之间的温差来评估温场均一性等[3,4]。对于96孔基座接入96根温度传感器进行温度实时采集，最能真实的反应出基座的温度场，然而却太费物力，也大大加重了计算量。因此，选择温度校准特征点是我们开展温度校准的前提工作。目前，特征点的选择一般都是根据基座形状的对称性，考虑边缘效应和空气对流等因素凭经验和常识来确定的，不具有科学性，当选择的特征点处于同一高或低温度区域时，势必会导致对PCR仪器温度性能指标评估的偏差。文中运用solidworks自带仿真软件，对PCR仪基座进行仿真模拟，划分不同温区，确定特征点，并加以实验验证。为今后开展PCR分析仪器热循环系统校准工作提供参考。

图1 PCR仪基座示意图

1 PCR仪热循环系统

PCR仪的核心是铝制或不锈钢的样品块，其上阵列式地分布着数量不等的PCR反应试管插孔，将封装有反应液的反应试管插入到插孔中进行PCR反应。如图2所示，在样品块下端均匀贴合着几片相互串联相接的基于Peltier效应的半导体制冷片(thermoelectric cooler，TEC)，完成快速升降温功能。在PCR仪翻盖或滑盖内侧有块尺寸与基座一致的金属热盖。反应时，热盖压下，作用于反应试管顶部的压力，使得试管和插孔更紧密的结合，且热盖在反应过程中始终保持在100℃左右，防止试管内样品蒸发后在试管顶部形成冷凝水，影响反应结果[5]。

图2 半导体式PCR仪结构示意图

2 传热建模及仿真

PCR仪按照事先设定好的循环程序，快速升降到设定温度值并保持一段时间，此时，通过平铺在基座下面的几片半导体制冷片传入系统的热量正好等于基座同仪器外壳及外界大气传出的热量，从而这段时间里PCR仪基座与周围环境进入了一个稳态导热阶段，这是一个常物性、无热源、稳态的三维导热问题，导热方程如式(1)：

(1)

对一台Mycycler型号的PCR仪的96孔基座实体建模如图1所示。模型长106.12mm、宽70.12mm、高14.7mm，内有96个PCR反应槽，以8行12列的阵列均匀分布。各个反应插孔之间相互孤立，大大减小了反应基座的热容，从而增加了PCR过程中的升降温速率。反应管采用的是标准的0.2mL的PP管。由于基座形状的对称性，在仿真时，选取基座的四分之一加以模拟即可。

2.1 基座下表面边界条件

PCR仪基座下表面均匀的平铺着几片半导体制冷片，在制冷片与基座之间涂有一层很薄的导热胶，使基座下表面受热更为均匀。当加热到设定温度稳定后，基座下表面将保持在恒定温度，故施加第一类边界条件。

2.2 基座上表面边界条件

金属热盖在PCR反应过程中始终保持在100℃左右。热盖与基座之间存在通过PP反应试管的热传导和空气对流传热，由于位于热盖和基座之间的空气的温度和热盖温度基本相同，故可以忽略空气对流传热。且PP反应试管的热导率系数很小，故通过反应试管热传导到基座上表面的热量可忽略不计。在仿真基座温度分布时，将上表面设为绝热条件。

2.3 基座侧面边界条件

PCR仪进入稳态传热时，基座底部的半导体制热/制冷片流入到基座系统的热量正好等于基座侧壁和插孔跟外界空气热传导损失的热量。所以侧壁的边界条件可以表示为：

(2)

式中：tw为基座的温度；tf为周围空气的温度；h为对流换热系数；l为热传导系数；n为侧壁的法向方向。

多次试验结果显示：当设定值为与室温温差最大的94℃时，PCR基座的边缘效应最明显，基座均匀性最差。选择变性温度时的稳态基座温场加以仿真分析。经过传热计算可得基座换热系数[6,7]：

h94℃=11.71(W/m2·K)

为了减小热损失，越来越多PCR仪基座侧壁都加有一层保温层，从而隔绝了样品基座与外界空气的直接接触，由于保温层传热系数很低，保温层外侧的温度和外界空气温度相近，故在仿真试验时只需在外侧壁面施加第一类边界条件即室温即可。仿真实验中对保温层外壁加载室温的第一类边界条件室温23℃，可以忽略侧壁空气对流对基座的影响。

2.4 仿真结果

对四分之一块基座进行实体网格划分，运用以上所述的边界条件对模型加载，最后得到其仿真结果如图3所示。

图3 四分之一个基座稳态温度分布图

3 实验验证及结论

利用keithley2000配合T型热电偶搭建的测温系统对Mycycler型号PCR仪基座个别插孔进行检测，并与仿真结果加以对比，结果如表1所示。

表1PCR仪基座插孔温度检测数据表 ℃

由表1可知，在基座四周加上保温层，明显改善了基座温度场分布的均匀性。在同加保温层的情况下，实测温度比仿真温度略高，厂家在设计产品时，考虑到仪器使用环境的空气流动会加强对流换热，从而适当的对设定温度实际值进行了修正，使得实际温度能满足生化反应的温度需求。PCR仪基座温度趋势为：中间位置反应插孔的温度最高，PCR基座靠近侧壁的反应插孔的温度比中间的反应插孔的温度低，尤其是拐角的那个插孔温度最低，实测与仿真得到的温度变化趋势是一致的。

为了进一步阐明基座的温场分布，利用搭建的测温系统对某一PCR仪基座反应试管插孔逐一进行了温度在线检测，其基座温场等温线示意图如图4所示，基座中心区域的温度均匀，边缘插孔的温度略低于中心区域(<0.4℃)，并且具有很好的对称性。

图4 某一PCR仪基座等温线示意图(℃)

分析了基座各孔的仿真温度、实际温度分布，并结合在PCR仪实际使用中四个拐角一般都放上空的反应试管起支撑作用这一情况以及基座结构特征和空气对流等因素考虑后，选用12路温度传感器分别布置在PCR仪基座不同温度区域，采集基座试管孔的温度信号，具体的温度校准特征点分布如图5所示。

图5 温度检测点分布图

国内尚没有PCR仪温度检定规程和校准规范，本论文研究只是一次探索，还需协同国内相关的研究机构，特别是计量研究部门、生产厂家等，尽早建立一套完善的PCR仪温度校准体系。

[1] Ji Youn Lee，Hee-Woong Lim,et al.Simulation and real-time monitoring of polymerase chain reaction for its higher efficiency[J].Biochemical Engineering Journal，29(2006):109～118

[2] 黄靖、陈章位，等.定量PCR仪热循环系统温度均匀性有限元仿真研究[J].仪器仪表学报,2010,31(5):1142-1146

[3] 张文超.聚合酶链式反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪)[J].生命科学仪器,2005,3(3):13-19

[4] Liu Jun，Weijun，Tianran Wang.Research and Realization of Algorithms for Gene-chip PCR Temperature-Tracking Control[C].The Ninth International Conference on Electronic Measurement & Instruments， 2009：3946-3949

[5] 薛生虎,李东升，等.基于多传感器融合技术的PCR仪温度校准系统[J].仪器仪表学报,2011,32(6):1232-1236

[6] 杨世铭，陶文铨，等.传热学[M] (第2版).北京：高等教育出版社，2006，43-76

[7] Yang S M，Zhang Z Z.An experiental study of natural convection heat transfer from a horizontal cylinder in high Rayleigh number laminar and turbulent region[C]//Hewitt G F .Proceedings of the 10th International Heat Transfer Conference.Brighton，1994，7：108-189