BAPTA-AM对OGD-再灌致Hep G-2细胞损伤的保护作用研究

宋必卫，骆钱芬

（浙江工业大学药学院，浙江杭州310032）

BAPTA-AM对OGD-再灌致Hep G-2细胞损伤的保护作用研究

宋必卫，骆钱芬

（浙江工业大学药学院，浙江杭州310032）

观察BAPTA-AM抗OGD-再灌对Hep G-2细胞的损伤作用及其机制.在氧/糖剥夺环境中培养细胞12 h后复糖复氧，检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）的活性，MTT法检测细胞活力，Annexin V-EGFP/PI荧光染色检测细胞死亡率，A23187拮抗实验及Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度等方法，评价BAPTA-AM抗氧/糖剥夺-再灌注致Hep G-2细胞损伤的作用.BAPTA-AM能明显抑制OGD-再灌引起的Hep G-2细胞培养液中的LDH、ALT、AST水平的升高，抑制Hep G-2细胞的坏死和细胞内游离钙浓度的升高，明显提高Hep G-2细胞活力，A23187减弱BAPTA-AM保肝作用.BAPTA-AM通过降低细胞内游离钙浓度，明显减轻OGD-再灌对HepG-2细胞的损伤.

BAPTA-AM；Hep G-2细胞；OGD-再灌

原发性肝癌是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之-，每年约有14万例患者死于肝癌，占我国癌症死亡率的第二位.肝切除和肝移植是肝脏肿瘤的惟一有效手段.肝移植必然要经历缺血-再灌注过程，导致肝缺血-再灌注损伤（Hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI），引起细胞膜脂质过氧化、细胞器结构损伤和代谢障碍，直接导致术后肝功能不全等致命并发症形成.肝移植病人中5%～30%出现原发性供肝无功能或功能不良，是仅次于免疫排斥的第二位再移植失败原因，其发生与供肝的切取、保存和再灌注所致的损伤密切相关［1-2］.此外，其它肝手术、肝脏严重炎症，肝血栓、肝外伤等疾病也能导致肝缺血缺氧损伤.尽管现代医学对肝损伤的研究比较深入，已从多方面探讨了肝损伤的发生机制，但保肝药物疗效仍难尽人意，寻找能有效防治肝缺血缺氧-再灌损伤药物，具有重要临床意义.

钙超载是公认的细胞损伤、死亡的共同环节［3］. BAPTA-AM［1，2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N，N，N′N′-tetraacetic acid］是一种具有高选择性的高效钙络合剂，用于控制细胞内钙水平以研究钙离子对各种细胞功能调节［4-5］，能有效地降低细胞内游离钙离子浓度，因此推测其能减轻HIRI所致的细胞损伤，挽救濒危细胞.本研究以OGD-再灌损伤Hep G-2细胞，通过测定细胞活力、凋亡率以及酶学指标来论证BAPTA-AM对肝细胞的保护作用.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞株

Hep G-2细胞株，购自南京凯基生物科技发展有限公司.

1.1.2 药品与试剂

BAPTA-AM脂质体（合肥恒星科技公司提供）；盐酸维拉帕米注射液（上海禾丰制药有限公司，批号110421）；RPMI.1640培养液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、DMSO（上海吉诺医药生物技术有限公司）；MTT（Sigma）；乳酸脱氢酶（LDH）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Annexin V-EGFP检测试剂盒（南京凯基生物技术有限公司）；A23187（Sigma）、Fura-2/AM钙离子荧光探针（海门市碧云天生物技术研究所）.

1.1.3 仪 器

垂直流超净台（ESCO，SCV-4A1）；CO2培养箱（Thermo Electron Corporation，Fonma 3111）；倒置光学显微镜（Nikon Eclipse，型号TS100-F DH1）；荧光显微镜（Leica Devices）；酶标仪（Molecular Devices，M2e）；离心机（Heraeus，LDZ5-2）.

1.2 方 法

1.2.1 OGD-再灌致细胞损伤模型的建立

将Hep G-2细胞以104个/孔接种于96孔培养板，RPMI 1640培养液培养24 h后换无糖1640培养液，置于密闭缺氧盒中，37℃下持续通入N240 min后同时关闭进、出气口，置于37℃恒温孵箱中培养，缺氧时间设置为4，8，12，16 h.打开缺氧盒以复氧，加入常规培养浓度葡萄糖，5%CO2孵箱中正常培养6 h，建立OGD-再灌模型［6-7］.正常对照组不作任何处理.每组设8个复孔.MTT法检测不同氧/糖剥夺时间对Hep G-2细胞活力的影响以确定合适损伤时间制备细胞损伤模型.

1.2.2 BAPTA-AM对OGD-再灌诱导HepG-2细胞损伤的影响

细胞培养同1.2.1.分组及处理见图1，每组设8个复孔.氧/糖剥夺条件下培养12 h后，复氧复糖，继续培养6 h.正常对照组不作特殊处理.MTT法检测细胞活力，收集培养上清液检测AST，ALT，LDH活性.细胞活力为

图1 BAPTA-AM抗OGD-再灌所致HepG-2细胞损伤（MTT法）±s，n=8）Fig.1 The effects of BAPTA-AM on HepG-2 cells against the injuries induced by deprivation of O2and glucose±s，n=8）

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI荧光染色观察BAPTA-AM对细胞死亡的影响

分组及处理同1.2.2.复氧、糖6 h后，弃上部培养液并用PBS清洗两次，加500μL Binding Buffer后再加入Annexin V-EGFP和Propidium Iodide（PI）各5μL，室温避光反应5 min，荧光显微镜观察结果，计数凋亡早期、凋亡中晚期及坏死细胞数［8-9］.

1.2.4 A23187拮抗BAPTA-AM抗Hep G-2细胞OGD-再灌损伤的作用

细胞处理同1.2.2，分组见图2.保护组和A23187组分别加入相应浓度的药物.正常对照组不作特殊处理，其余各组均置于氧/糖剥夺环境中培养12 h，再复氧复糖培养6 h，MTT法检测细胞活力［10］.

图2 A23187对模型组和保护组的细胞活力的影响±s，n=8）Fig.2 Effects of A23187 to model group and protectivegroups on viabilities of HepG-2 cells±s，n=8）

1.2.5 细胞内游离钙浓度的测定

分组及处理同1.2.2.同前法清洗细胞3次，加入终浓度为5μmol/L的Fura-2/AM.37℃避光温育30 min，同法清洗3次以去除多余的Fura-2/ AM.设定激发波长为340 nm，发射波长为510 nm，测定荧光强度.再加入0.4%的Triton X-100及5 mmol/L的CaCl2后测定最大荧光强度值Fmax，在Fmax的基础上加入10 mmol/L的EGTA后的测定值为最小荧光强度值Fmin.按以下公式计算细胞内游离钙浓度：Kd（F-Fmin）/（Fmax-F）；Kd=224 nmol/L，为Fura-2与Ca2+的解离常数［11-12］（每个样本测定后均需减去自发荧光再进行计算）.

1.2.6 统计处理

采用Graph Pad Prism软件（One-way ANOVA）处理，数据用±s表示，以p＜0.05为差异有显著性意义.

2 结 果

2.1 OGD-再灌致细胞损伤模型的建立

如图3所示，固定复氧/糖时间为6 h.细胞活力随着氧/糖剥夺时间延长而逐渐减小.氧/糖剥夺12 h时，细胞的活力降低至正常对照组的59%，二者间差异极显著性（P＜0.001）.因此选用氧/糖剥夺12 h来制作HepG-2细胞损伤模型.

图3 OGD时间对HepG-2细胞活性的影响±s，n=8）Fig.3 Effect of deprivation of O2&glucose on viabilities of Hep G-2 cells（±s，n=8）

2.2 BAPTA-AM抗OGD-再灌所致HepG-2细胞损伤

从图1可看出：Hep G-2细胞缺糖缺氧12 h后，细胞活性严重受损，与正常对照组相比，差异极明显（P＜0.001）.无论是预防性（缺糖缺氧前）给药（图1a），还是治疗性给药（图1b），BAPTA-AM均可呈剂量依赖性地减轻细胞损伤，在3 nmol/L时，作用达峰值（活力分别由模型组的52.9%和55.9%上升到73.9%和73%）.预防性给予维拉帕米对Hep G-2细胞有保护作用但需要更高浓度（100 nmol/L），但治疗性用药则无明显作用.该结果证明：BAPTAAM对肝细胞的保护好，且明显优于维拉帕米.

2.3 BAPTA-AM改善HepG-2细胞损伤所致的酶学指标改变

Hep G-2细胞经OGD-再灌损伤后，细胞内酶释放，导致培养上清液中的ALT、AST和LDH水平明显升高.预防性给予BAPTA-AM，可浓度依赖性抑制ALT，AST和LDH活性的升高，当BAPTAAM为3 nmol/L时效果最佳（图4）.

2.4 AnnexinV-EGFP荧光染色观察BAPTA-AM抗细胞死亡作用

凋亡和坏死是细胞的两种死亡方式.细胞经OGD-再灌损伤后，在荧光显微镜下观察，可看见大部分细胞被染色.部分细胞固缩变小，发出绿色荧光，为凋亡早期状态；部分细胞裂解成碎块，并同时发出绿色荧光和红色荧光，表明细胞已进入凋亡晚期；细胞膨大，只发出红色荧光的，为坏死细胞.模型组细胞总死亡率高达（39.2±2.4）%.加入3 nmol/L BAPTA-AM后，出现红色荧光标记的细胞明显减少，被染的细胞基本处于凋亡早期（绿染）（图5），细胞的总死亡率显著性下降（25.2± 4.3）%，尤其是坏死率，由模型组的（63.8± 4.2）%下降了到（32.0±2.3）%.该结果表明OGD-再灌导致HepG-2细胞坏死与凋亡，且以坏死为主.BAPTA-AM能极显著抑制OGD-再灌所致的细胞坏死与凋亡（表1）.

2.5 A23187拮抗BAPTA-AM对HepG-2细胞的保护作用

由图2可知：A23187（1μg/m L）显著加重OGD-再灌所致的细胞损伤，拮抗BAPTA-AM的细胞保护作用，提示BAPTA-AM通过减轻钙超载机制保护细胞.

2.6 BAPTA-AM对细胞内游离钙浓度的影响

经OGD-再灌损伤后，HepG-2细胞内的游离钙浓度较正常对照组有明显升高，从（124.90±27.17）nmol/L上升到（237.36±38.49）nmol/L，约升高了1倍.BAPTA-AM浓度依赖性降低剂细胞内游离钙浓度.当BAPTA-AM为3 nmol/L时，游离钙浓度达到（146.78±24.31）nmol/L，与正常对照组接近.该结果进一步表明BAPTA-AM通过减轻钙超载机制保护细胞（图6）.

图4 BAPTA-AM改善Hep G-2细胞损伤所致的酶学指标变化±s，n=8）Fig.4 Effects of BAPTA-AM on AST、ALT和LDH levels in supernatant±s，n=8）

图5 Annexin V-EGFP荧光染色后的HepG-2细胞Fig.5 The morphology of HepG-2 cells labeled by AnnexinV-EGFP/PI

表1 BAPTA-AM对HepG-2细胞凋亡和坏死的影响1）±s，n=8）Table 1 Effects of BAPTA-AM on death rate of HepG-2 cells±s，n=8）

表1 BAPTA-AM对HepG-2细胞凋亡和坏死的影响1）±s，n=8）Table 1 Effects of BAPTA-AM on death rate of HepG-2 cells±s，n=8）

注：1）与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；2）凋亡早期细胞为可逆性损伤，不纳入死亡细胞统计.

58.3±22.0 4 41.6±22.0模型 14.9±0.3 39.2±2.4 36.2±4.2 6 63.8±4.2 BAPTA-AM 0.3 14.2±2.5 38.0±2.9 42.9±1.3 57.1±1.3 1 15.3±3.0 29.1±5.5*57.1±3.0 42.9±3.0 3 20.1±3.4 25.2±4.3**68.0±2.3*32.0±2.3*维拉帕米晚期凋亡 坏死空白对照 3.8±0.6***2.8±0.6***组别 剂量/（nmol·L-1） 早期凋亡率/% 总死亡率/% 死亡构成比2）/% 100 20.4±1.5 30.5±3.1 53.0±3.4 47.0±3.4

图6 BAPTA-AM对HepG-2细胞内游离钙浓度的影响±s，n=8）Fig.6 Effects of BAPTA-AM on cytoplasmic free Ca2+concentrations±s，n=8）

3 结 论

HIRI是指由于各种原因导致肝脏血流中断、不足等造成肝脏缺血，当再进行灌注，肝脏血供恢复后，不仅不能使肝脏功能恢复，反而使肝细胞功能障碍及结构破坏加重的现象，多发生于肝移植、肝叶切除等复杂肝脏外科手术中.目前，各种预防及治疗措施已逐渐被运用，主要有：1）缺血预处理和缺血后处理：增加肝脏对缺血的耐受性；2）减轻HIR的药物：如抗氧化剂（川芎嗪、丹参、银杏叶）、钙通道阻滞剂（维拉帕米、三七总皂甙）、PAF拮抗剂（山莨菪碱、海风藤酮）、细胞因子活性抑制剂（赖氨匹林）、蛋白酶体抑制剂（乌司他丁）等等，但这些措施效果并不显著.因此，研究开发针对HIRI的有效药物，降低病死率，是急需解决的重大课题.

本实验采用OGD-再灌损伤建立肝缺血再灌注损伤模型，发现OGD-再灌损伤HepG-2细胞后，细胞活力显著下降，培养上清液中AST、ALT、LDH水平明显升高，细胞内Ca2+大大升高，BAPTA-AM能显著减轻上述损伤性变化.Annexin V-EGFP荧光染色表明OGD-再灌能诱导Hep G-2细胞出现典型的细胞凋亡与坏死且以后者为主，BAPTA-AM则极明显减少细胞坏死.本结果在细胞水平证BAPTA-AM对肝缺血-再灌损伤有上佳的防治作用，其最佳浓度为3 nmol/L，其作用机制是直接降低细胞内钙，减轻或消除钙超载，与蔡雁［13］、付再林［14］等报道的BAPTA-AM抗肝细胞凋亡作用基本一致.大量研究证明，钙超载和自由基形成二者互为因果，是缺血-再灌损伤的主要机制.BAPTA-AM能通过减轻钙超载，大大降低自由基形成［15］.

本实验还发现：经典的钙通道阻断剂维拉帕米在高浓度时100 nmol/L，对OGD-再灌诱导的Hep G-2细胞损伤有预防作用但治疗效果差.BAPTA-AM作用的效能和效价强度均高于维拉帕米.因此，一旦将BAPTA-AM用于临床，疗效会大大优于维拉帕米.究其原因，可能在于二者作用不同：维拉帕米阻断钙通道，故能预防钙超载的发生，但其不能直接降低细胞内钙，对已存在的钙超载无效，自然临床治疗效果差.BAPTA-AM直接降低细胞内钙，减轻或消除钙超载，故既可预防也能治疗钙超载损伤.BAPTA-AM有可能成为治疗HIRI的有效治疗药，开发前景极好.

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（责任编辑：陈石平）

Protection of Hep G-2 cell of BAPTA-AM against deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced injury

SONG Bi-wei，LUO Qian-fen
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To study the protective effects and mechanism of BAPTA-AM on Hep G-2 cells against deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced injury，oxygen-glucose deprivation followed by 12 h of reoxygenation-glucose reperfusion was applied to induce Hep G-2 cells injure at various concentrations of BAPTA-AM.The viabilities of Hep G-2 cells，the levels of ALT，AST，LDH were measured.Cell death was evaluated by Annexin V-EGFP/PI labeling method.Effects of A23187 against BAPTA-AM on viabilities of Hep G-2 cells was also measured.Cytoplasmic free Ca2+concentrations were tested by a Ca2+labeling indicator，Fura-2/AM.BAPTA-AM could significantly inhibit deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced hepatocyte injury，prevent Hep G-2 cells from cytoplasm Ca2+concentrations increase and suppress necrosis.BAPTA-AM could effectively protect Hep G-2 cells against deprivation of O2and glucose/reperfusion induced injury.

BAPTA-AM；Hep G-2 cells；deprivation of O2and glucose/reperfusion

R965

A

1006-4303（2013）02-0133-05

2012-03-09

宋必卫（1956-），男，安徽岳西人，教授，研究方向为细胞和分子药理学，E-mail：bwsong@zjut.edu.cn.